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副溶血性弧菌溶血毒素基因：从克隆表达至应用的深度剖析

一、引言

1.1副溶血性弧菌简介

副溶血性弧菌（Vibrioparahaemolyticus）隶属弧菌科弧菌属，是一种嗜盐性革兰氏阴性菌。其菌体形态丰富多样，在不同培养条件下，可呈现弧状、杆状、丝状等形态，无芽孢，具有单端鞭毛，运动能力强。作为一种海洋细菌，副溶血性弧菌广泛分布于近海岸的海水、海底沉积物以及鱼、虾、蟹、贝类等海产品中。在我国，华东地区沿岸海水的副溶血性弧菌检出率处于47.5%-66.5%区间，海产鱼虾的平均带菌率达45.6%-48.7%，在夏季，其带菌率甚至可高达90%以上。除了海洋环境和海产品，畜禽肉、咸菜、咸蛋、淡水鱼等也可能被副溶血性弧菌污染。

副溶血性弧菌对生长环境有一定要求，在含盐量0.5%-8%的环境中方可生长，最适宜的含盐量为2%-4%，在无盐或含盐浓度过高（10%以上）的培养基中难以存活。其适宜生长温度为5-44℃，最佳生长温度是30-35℃，当温度低于4℃时生长停止，适宜生长的pH范围为7.5-8.5，pH为7.7时最为适宜，在pH低于6的酸性条件下生长状况不佳。该菌对酸敏感，在普通食醋中5分钟即可被杀灭，对热的抵抗力也较弱，50℃下20分钟、65℃下5分钟或80℃下1分钟就能将其杀死，对常用消毒剂的抵抗力同样很弱。

副溶血性弧菌是重要的食源性致病菌，人一旦摄入被其污染的食物，极易引发食物中毒和急性胃肠炎。由其引起的食物中毒通常起病急骤，潜伏期一般在2-24小时，多数为10小时左右。主要症状表现为腹痛、腹泻、恶心、呕吐、畏寒及发热等。腹痛多为阵发性绞痛，常出现在上腹部、脐周或回盲部；腹泻每日可达3-20余次，大便性状多样，多数为黄水样或黄糊便，约2%-16%的患者会出现典型的血水或洗肉水样便，部分病人的粪便可为脓血样或粘液血样，但里急后重症状较少见。重症患者可能因严重脱水，导致皮肤干燥、血压下降，进而引发休克，少数病人还可能出现意识不清、痉挛、面色苍白或发绀等症状，若抢救不及时，可能危及生命。近年来，随着人们对海产品消费需求的增加以及海鲜运输流通范围的扩大，副溶血性弧菌引发的食物中毒事件呈上升趋势，不仅在沿海地区频发，在内地城市也时有发生，对公众健康构成了严重威胁。

1.2溶血毒素基因概述

副溶血性弧菌能够产生多种溶血毒素，这些溶血毒素在其致病过程中扮演着关键角色，而编码这些溶血毒素的基因主要包括耐热直接溶血素基因（thermostabledirecthemolysin，tdh）、相对耐热直接溶血毒素基因（TDHrelatedhemolysin，trh）和不耐热溶血素基因（thermolabilehemolysin，tlh）。

耐热直接溶血素基因（tdh）编码的TDH蛋白是副溶血性弧菌重要的致病因子，分子量约为42kDa，等电点在4-5之间，具备溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性等多种生物学活性。典型的神奈川阳性菌株通常携带有tdh1和tdh2两个染色体基因拷贝，二者同源性达97.2%，但tdh2对溶血现象起主要作用。此外，从表型阴性株中还克隆到tdh3和tdh4基因拷贝，它们也能在大肠杆菌中表达并产生具有溶血活性的TDH。tdh的表达受操纵子ToxRS的调节，ToxRS的过量表达可使tdh基因表达上调，但不同tdh基因拷贝对ToxRS调节的响应存在差异。

相对耐热直接溶血毒素基因（trh）编码的TRH与TDH具有相似的免疫原性，抗原性部分交叉。TRH具有溶血作用和肠毒素作用，分子量为48kDa，等电点是4.6，不过TRH不耐热，在60℃以上10分钟即可灭活。编码TRH和TDH的基因trh和tdh核苷酸序列同源性较高，trh与tdh1的同源性达68.4%，与tdh2的同源性达68.6%。

不耐热溶血素基因（tlh）编码的TLH是近年来发现的另一种溶血毒素，该基因位于染色体上，长度约1.3kb。前蛋白和成熟蛋白分别含有418个氨基酸和398个氨基酸，分子量分别为47.5kDa和45.3kDa。TLH是一种非典型的磷脂酶，本身无直接溶血活性，关于其在副溶血性弧菌中的功能和致病性，目前尚不十分明确。但由于tlh基因具有种属特异性，无论是临床分离株还是环境分离株都含有该基因，因此在副溶血性弧菌的检测中具有很强的实用性。

1.3研究目的与意义

本研究旨在对副溶血性弧菌溶血毒素基因进行克隆表达，并对其表达产物的生物学活性和应用进行深入研究。通过