第四章 核酸电泳.pptVIP

2）荧光光度法荧光染料溴化乙锭，可嵌入到碱基平面，而发出荧光，且荧光强度与核酸含量呈正比。适用于低浓度核酸溶液的定量分析。（1-5ng）第29页，共72页，星期日，2025年，2月5日EB与DNA的结合第30页，共72页，星期日，2025年，2月5日500?l全血提取的基因组DNA电泳动物组织提取基因组DNA第31页，共72页，星期日，2025年，2月5日纯度鉴定紫外分光光度法：在260nm和280nm处测定DAN溶液的光吸收，纯的DNA，低于此值表明制备物中留有蛋白质成份。高于此值表明有RNA的残留量。A260与A280之比应在1.80；纯的RNAA260与A280之比应在2.0。A260/A280比值是纯度检测的重要指标。第32页，共72页，星期日，2025年，2月5日完整性鉴定凝胶电泳法：基因组DNA电泳，在电场中泳动慢，如果发生降解，可出现电泳图谱脱尾现象；总RNA电泳，观测各条带的含量，提示是否存在RNA降解；如加样槽中存在条带，可能是DNA污染。第33页，共72页，星期日，2025年，2月5日第34页，共72页，星期日，2025年，2月5日核酸电泳第35页，共72页，星期日，2025年，2月5日1.应与进行普通微生物实验的区域分离好2.使用标有“无RNA酶”的商品试管,吸头,溶液和水.通常新的无菌处理过的塑料试管和吸管无RNA酶3.双蒸水(ddH2O)和溶液应该用RNA酶的抑制剂DEPC(焦碳酸二乙酯)进行处理:每100mL溶液或水中加入0.1mLDEPC原液,放在摇床上充分混匀并在37℃下作用数小时.然后将溶液高压灭菌15min使DEPC失活4.分离RNA以前,将一些实验室玻璃制品置于烤箱在300℃烘烤4h以灭活核酶.如有可能,将其他设备也灭菌处理前期准备:第36页，共72页，星期日，2025年，2月5日1.在Trizol试剂的保护下，匀浆组织，静置裂解细胞释放内含RNA，Trizol试剂对RNA有保护作用，能抑制RNA酶的活性，并且同时有裂解细胞的作用。2.将匀浆液中加入苯酚，去除裂解液中的脂类，蛋白和DNA，离心后取出上清液，里面含有RNA，而杂志留在苯酚中。3.在上清液中加入等体积异丙酮，混匀后，静置片刻，离心，将RNA沉淀于管底。弃上清，用75%乙醇洗涤沉淀，离心。去上清，将沉淀在真空干燥器中烘干。第37页，共72页，星期日，2025年，2月5日核酸电泳第38页，共72页，星期日，2025年，2月5日带电物质在电场中向相反电极移动的现象称为电泳(electrophoresis)。各种生物大分子在一定pH条件下．可以解离成带电荷的离子。在电场中会向相反的电极移动。人们采用各种材料作为支持电泳介质．创造出许多新方法．其中以琼脂糖和聚丙烯酰胺为支持介质的凝胶电泳最为突出。自从琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶被引入核酸研究以来．按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术．已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段．第39页，共72页，星期日，2025年，2月5日第40页，共72页，星期日，2025年，2月5日凝胶电泳的原理：当一种分于被放置在电场当中时、它们就会以一定的速度移向适当的电极。这种电泳分子在电场作用下的迁移速度，叫做电泳的迁移率。它同电场的强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比。也就是说电场强度越大电泳分子所携带的净电荷数量越多，其迁移的速度也就越快。反之则较慢。电泳的迁移率又是同分子的摩擦系数成反比的。由于在电泳中使用了一种无反应活性的稳定的支持介质，如琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶等,降低了对流运动．故已知摩擦系数是分子的大小、极性及介质粘度的函数．因此根据分子大小的不同、构型或形状的差异。以及所带的净电荷的多寡。便可以通过电泳将蛋白质或核园分子混合初中的各种成分被此分离开来。第41页，共72页，星期日，2025年，2月5日1.琼脂糖凝胶电泳2.聚丙烯酰胺凝胶电泳3.脉冲电泳凝胶电泳第42页，共72页，星期日，2025年，2月5日琼脂糖是一种从红色海藻产物琼脂中提取而来的线性多糖聚合物。当琼脂糖加热到沸点后冷却凝固便会形成良好的电泳介质．琼脂糖由1,3连接的吡喃型β-D-半乳糖与1,4连接的3,6脱水吡喃型α-L-半乳糖组成。

??????琼脂糖分子呈随机线团状，凝结初期由于氢键的作用形成双链分子，而后再发生双链分子间的连接直至最后固化。由于链间的连接是靠氢键的作用，所以一切会破坏氢键形成的因素都会影响凝胶的形成。1.琼脂糖凝胶电泳根据琼脂糖的溶解温度，把琼脂糖分为一般琼脂糖和