蛋白质研究原理与技术.pptxVIP

;蛋白质纯化与鉴定实验指南，朱厚础等译，2000，科学出版社

TheRecombinantProteinHandbook,ProteinAmplificationandSimplePurification,18-1142-75

ProteinPurification,Handbook,18-1132-29;;蛋白分离纯化的目的与意义;蛋白质纯化总原则（GeneralPrinciple）;;（一）蛋白纯化方法概述

（二）常用层析技术介绍

（三）常用电泳技术介绍;基础——不同蛋白质理化性质的差异

原因——氨基酸的组成与数目不同

与蛋白纯化相关的理化性质

分子大小

分子形状

带电特性

溶解特性

与配体特异性结合不同

吸附性质

变性和复性;1.分子大小;透 析;第11页，共159页。;超 滤;凝胶过滤; 超速离心;2.分子形状;密度梯度离心;SDS;3.电 荷;等电聚焦;双向凝胶电泳;离子交换层析;4.溶解度;盐析;有机溶剂分级沉淀;等电点沉淀法;5.配体特异性结合;免疫亲和层析;6.吸附性质;疏水层析;7.变性和复性; 通用性？ 独特性！

程序化！

;;;1.基本原理;基本原理图;2.装置;超声波破碎仪;第38页，共159页。;Howtoobtaintherecombinantproteins?;;;;;3.亲和层析;原理图;;重组蛋白制备SDS－PAGE图谱;第48页，共159页。;第49页，共159页。;亲和标签;亲和标签选择因素;亲和标签;3.1His6-Ni亲合层析

（金属螯合层析）;His标签优缺点;3.2谷胱甘肽巯基转移酶蛋白标签(GST);3.3几丁质结合肽;基于几丁质与几丁质结合结构域的亲合纯化;3.4麦芽糖结合蛋白（MBP）;MBP标签亲合纯化;3.5与抗生物素蛋白特异结合的亲和标签;基于亲合素与生物素的亲合纯化;3.6FLAG标签，T7标签和S标签;3.7亲和标签的去除;剪切方法;4.凝胶过滤层析;Pharmacia(GE);原理;应用范围;5.离子交换层析;选择标准;第71页，共159页。;第72页，共159页。;应用范围;6.疏水作用层析;层析方法;;蛋白质常用电泳技术;机制：

1、因SDS是阴离子，使多肽表面覆盖的负电荷远远超过蛋白质分子原有的电荷量，消除了原有的电荷差异。

2、改变了蛋白质单体分子的构象，不同蛋白质与SDS复合物的短轴长度相同，长轴长度随其分子量的大小呈正比变化。;;电泳法测定未知蛋白的分子量;;第82页，共159页。;2.等电聚焦电泳;第84页，共159页。;第85页，共159页。;3.双向电泳;Isoelectricfocusing;TwoDimensionalElectrophoresisofE.coliProteins;第89页，共159页。;蛋白纯化原则

（GuidelinesforProteinPurification）;纯化目的确定纯化目标;ASSAY:Amethodthatmeasurestheamountofaspecificprotein,inamixtureofothers.Ifpossible,theassayshouldgiveanestimateoftheabsoluteconcentration(e.g.mg/ml).Relativeconcentrationisthenextbest.

Themethodchosenwillultimatelydependonthepropertiesofthetargetprotein.

Mostcommonare:

enzymaticassays.

ligand-bindingassays

immunologicalassays;尽量减少纯化步骤;减少每步操作时间

toavoidlengthyprocedureswhichrisklosingactivity/reducingrecovery

减少添加物

additivesmayneedtoberemovedinanextrapurificationstepormayinterferewithactivityassays

早期除去降解物

forexample,proteases

每步使用不同的纯化方法

totakeadvantageofsamplecharacteristicswhichcanbeusedforseparation(size,charge,hydrophobici