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葛根总黄酮对NB4细胞自噬影响的实验研究

摘要

本实验旨在研究葛根总黄酮对NB4细胞自噬的影响及其潜在机制。通过不同浓度葛根总黄酮处理NB4细胞，运用Westernblot、激光共聚焦显微镜等技术检测自噬相关蛋白表达、自噬体形成情况，并分析细胞活力变化。结果表明，葛根总黄酮能够诱导NB4细胞发生自噬，且在一定浓度范围内，随着浓度升高，自噬水平增强，同时细胞活力呈现下降趋势。本研究为深入了解葛根总黄酮在血液系统疾病治疗中的作用机制提供了实验依据。

关键词

葛根总黄酮；NB4细胞；自噬；细胞活力

一、引言

自噬是一种高度保守的细胞自我降解过程，在维持细胞内环境稳定、应对各种应激以及细胞的生长、发育和衰老等过程中发挥着重要作用。异常的自噬水平与多种疾病的发生发展密切相关，包括肿瘤、神经退行性疾病等[1]。在肿瘤研究领域，自噬对肿瘤细胞具有双重作用，既可以促进肿瘤细胞在恶劣环境下的存活，也能诱导肿瘤细胞死亡[2]。因此，调控肿瘤细胞自噬成为肿瘤治疗的新靶点。

NB4细胞是急性早幼粒细胞白血病（APL）细胞系，在研究血液系统肿瘤的发病机制和治疗方法中被广泛应用。葛根总黄酮是从葛根中提取的一类重要活性成分，具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性[3]。已有研究表明，葛根总黄酮在多种肿瘤细胞中展现出抑制增殖、诱导凋亡等作用，但关于其对NB4细胞自噬的影响尚未见报道。本实验通过研究葛根总黄酮对NB4细胞自噬的影响，旨在揭示其潜在的抗肿瘤机制，为葛根总黄酮在血液系统肿瘤治疗中的应用提供理论支持。

二、材料与方法

（一）实验材料

细胞株：NB4细胞株购自中国典型培养物保藏中心。

药品与试剂：葛根总黄酮（纯度≥98%，购自某生物科技有限公司）；RPMI1640培养基、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶（购自Gibco公司）；自噬相关蛋白LC3、p62抗体（购自CellSignalingTechnology公司）；CCK-8试剂盒（购自同仁化学研究所）；Hoechst33342、MDC（购自Sigma公司）。

仪器设备：二氧化碳培养箱（ThermoFisherScientific公司）；倒置相差显微镜（Olympus公司）；流式细胞仪（BD公司）；激光共聚焦显微镜（Leica公司）；Westernblot相关设备（Bio-Rad公司）。

（二）实验方法

细胞培养：将NB4细胞置于含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素100U/mL，链霉素100μg/mL）的RPMI1640培养基中，在37℃、5%CO?的培养箱中培养，每2-3天换液一次，待细胞密度达到80%-90%时进行传代。

分组与处理：将对数生长期的NB4细胞以1×10?cells/mL的密度接种于6孔板中，分为对照组（加入等体积的PBS）、葛根总黄酮低浓度组（50μg/mL）、中浓度组（100μg/mL）、高浓度组（200μg/mL），每组设置3个复孔。分别加入相应处理因素，继续培养24h。

CCK-8法检测细胞活力：培养结束后，每孔加入10μLCCK-8试剂，继续孵育2h，使用酶标仪在450nm波长处测定各孔吸光度（OD值），计算细胞活力，公式为：细胞活力（%）=（实验组OD值/对照组OD值）×100%。

Westernblot检测自噬相关蛋白表达：收集各组细胞，用RIPA裂解液提取总蛋白，BCA法测定蛋白浓度。取等量蛋白进行SDS-PAGE电泳，转膜后用5%脱脂牛奶封闭2h，加入LC3、p62一抗（1:1000稀释），4℃孵育过夜。次日，TBST洗膜3次，每次10min，加入相应二抗（1:5000稀释），室温孵育2h。再次洗膜后，用ECL化学发光试剂盒显色，ImageJ软件分析蛋白条带灰度值，以β-actin为内参，计算目的蛋白相对表达量。

激光共聚焦显微镜观察自噬体形成：将细胞接种于激光共聚焦专用培养皿中，分组处理同前。培养结束后，用4%多聚甲醛固定15min，PBS冲洗3次，每次5min。加入MDC染色液（50μmol/L），37℃避光染色30min，PBS冲洗后，在激光共聚焦显微镜下观察自噬体形成情况并拍照。

Hoechst33342染色观察细胞核形态：将细胞接种于24孔板中，分组处理同前。培养结束后，用4%多聚甲醛固定15min，PBS冲洗3次，每次5min。加入Hoechst33342染色液（10μg/mL），室温避光染色10min，PBS冲洗后，在荧光显微镜下