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细胞培养中常见微生物污染检测ATP荧光法标准化研究报告

EnglishTitle:StandardizationResearchReportonATPFluorescenceMethodforDetectionofCommonMicrobialContaminationinCellCulture

摘要

细胞培养技术在生物医药领域的应用日益广泛，而微生物污染是影响细胞培养质量和细胞产品安全的关键因素。本研究针对传统微生物检测方法存在的时效性不足、操作复杂等问题，系统分析了ATP荧光检测法在细胞培养微生物污染检测中的应用价值。研究显示，ATP荧光法基于萤火虫发光原理，通过检测ATP与荧光素-荧光素酶反应发出的光强度来确定微生物污染程度，具有检测快速、灵敏度高、操作简便等优势。该方法可在10分钟内完成检测，与传统的菌落计数法具有高度一致性，能够有效满足细胞制剂质量检验对快速检测的需求。本报告详细阐述了ATP荧光法的技术原理、适用范围、操作流程和验证方法，旨在为细胞制品微生物污染检测提供标准化参考，促进细胞治疗产品的质量控制和产业化发展。

关键词

细胞培养；微生物污染；ATP荧光检测；质量控制；标准化

CellCulture;MicrobialContamination;ATPFluorescenceDetection;QualityControl;Standardization

正文

研究背景与意义

微生物污染是细胞培养过程中最常见且危害最严重的问题之一。在体外细胞培养环境中，细菌、真菌等微生物极易生长繁殖，其污染可能导致细胞死亡、增殖减缓、功能改变、产量降低和毒素污染等一系列严重后果，严重影响细胞培养质量和细胞产品的安全性。

目前，生物制品的无菌检测主要依据现行版《中华人民共和国药典》中生物制品无菌试验规程，对细菌、真菌污染进行检测。然而，细胞制剂从生产到临床应用通常只有几个小时的质量检验时间，针对每项质检指标的时间更为有限。药典规定的传统培养法虽然可靠性高，但检测周期长，结果严重滞后，无法满足细胞制剂质量检验对快速检测的迫切需求。

除传统分离培养法外，基于核酸（DNA/RNA）的检测技术是目前常用的微生物检测方法。然而，核酸检测需要复杂的样品前处理和DNA扩增过程，且通常只能针对单一或少数几种特定微生物进行检测，难以实现大量不同种类未知微生物污染的同时快速检测。

为确保细胞治疗的安全性和有效性，必须建立科学的细胞制剂质量控制标准体系。国家卫生计生委与食品药品监管总局共同制定的《干细胞制剂质量控制及临床前研究指导原则（试行）》（国卫办科教发〔2015〕46号）对供体细胞外源微生物污染提出了明确的检测要求，但目前尚缺乏针对细胞制剂微生物污染检测的相关技术标准。

技术原理与优势

三磷酸腺苷（ATP）荧光检测法是基于萤火虫生物发光原理建立的快速检测技术。该方法通过检测ATP与荧光素-荧光素酶反应发出的光强度来确定细胞ATP含量。由于ATP发光反应的发光强度与ATP含量成正比，而每个活细胞中含有相对恒定的ATP含量，细胞死亡后ATP会迅速被细胞内酶降解，因此通过ATP含量可以间接测量样品中微生物数量。

研究表明，每个细菌细胞中ATP含量均值约为2.5×10?1?摩尔，每个真菌细胞中ATP含量均值约为5.0×10?1?摩尔。将污染样品中的细菌和真菌细胞裂解后，采用生物发光法测定ATP含量，即可推算出样品中含有的活菌量，整个过程可在10分钟内完成。

通过经典的微生物菌落计数法进行方法学验证，结果显示ATP荧光检测法与菌落计数法的检测结果具有高度一致性，证明该方法在细菌和真菌等微生物检测方面具有可靠性和适用性。

技术成熟度与应用前景

目前，ATP荧光检测技术已趋于成熟，市场上有多种ATP检测仪器和试剂盒可供选择，并已广泛应用于食品接触表面和医疗机构环境消毒效果评价、医疗器械及物表清洁度检测、食品中细菌总数快速现场检测等领域。

ATP荧光检测法是最具潜力的即时检测菌落总数的快速检测方法，具有灵敏度高、可靠性强且能同时检测不同种类微生物的优点。本项目建立的基于ATP荧光法的细胞制品微生物污染检测标准，旨在为生产和科研中细胞培养物微生物污染的检测提供标准化参考方法。

介绍修订的企事业单位或标委会

主要参与单位：中国食品药品检定研究院

中国食品药品检定研究院（以下简称中检院）作为国家食品药品监督管理总局的直属事业单位，是我国药品、生物制品、医疗器械等产品质量检验和标准研究的权威机构。中检院在细胞治疗产品质量控制领域具有深厚的技术积累和丰富的实践经验。

在细胞治疗产品微生物污染检测标准制定过程中，中检院组织了一支由微生物学、细胞生物学、检验检测等多学科专家组成的技术团队，系统评估了国内外现有微生物检测技