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抑制乙酰胆碱酯酶活性的蛇足石杉内生真菌筛选

【摘要】目的筛选具有乙酰胆碱酯酶抑制活性的蛇足石杉内生真菌菌株。方法采用DTNB显色法，优化条件后筛选；对蛇足石杉的29株内生真菌菌株发酵液醇提物进行了酶抑制活性的初步筛选。结果xg，g8，g5，xgc2，xy7对乙酰胆碱酯酶具有较高的抑制率，其IC50分别是，，，，μg/ml。结论蛇足石杉内生真菌xg，g8，g5发酵醇提物能够较为显着地抑制乙酰胆碱酯酶，为寻找具有乙酰胆碱酯酶抑制作用的药用资源开辟了一条新的途径。

【关键词】乙酰胆碱酯酶蛇足石杉内生真菌

老年痴呆症是一种严重危害人类健康的疾病。它的发病机理之一是在神经冲动传导过程中缺乏乙酰胆碱。乙酰胆碱酯酶能分解乙酰胆碱，因此治疗AD的一个策略就是用AChE抑制剂来减少乙酰胆碱的消耗,从而提高胆碱能神经元的兴奋性,达到缓解症状的效果［1］。

我国药学工作者从药用植物蛇足石杉Huperziaserrata()中提取得到高效、可逆的AChE抑制剂——石杉碱甲［2］。由于蛇足石杉天然资源日渐枯竭，限制了石杉碱甲的开发利用。目前国内外学者主要是通过化学合成、植物组织培养来解决天然资源匮乏问题［3］。本文尝试从蛇足石杉内生真菌中寻找具有AChE抑制活性的菌株，为改善蛇足石杉资源寻找一条可能的出路。

1器材与方法

供试内生真菌供试用29株内生真菌由本实验室李娜博士从安徽宣城地区野生蛇足石杉植株内分离得到，经纯化后现保存于江苏大学生药学实验室，待分类鉴定。

试剂及仪器碘化硫代乙酰胆碱、5,5-二硫代-2-硝基苯甲酸、石杉碱甲纯品，中国科学院上海药物所朱大元教授惠赠；高氯酸，国药集团化学试剂有限公司AR级；医用95％乙醇，山东广源医药酒精有限公司。

XD711酶标分析仪，上海迅达医疗仪器有限公司；spectraMAX190多功能酶标仪，美国MolecuLarDevices；R200/V旋转蒸发仪，德国BǔCHI公司；台式高速冷冻离心机，德国Beckman公司；SPX-250B生化培养箱，上海跃进集团；QYC-211摇床，上海福玛试验设备有限公司；SW-CJ-2FD超净工作台，苏净集团；U-410超低温冰箱，英国NEWBRUNSWICKSCIENTIFE公司。

AChE粗提物的制备：取小鼠大脑组织制成1％组织匀浆，即为AChE粗提物［4］。

发酵液制备：采用马铃薯葡萄糖液体培养基培养蛇足石杉内生真菌，28℃，120r/min，发酵7d，做为供试发酵液。

蛇足石杉内生真菌发酵产物的粗制：供试发酵液反复冻融破碎菌丝体细胞，再经95％乙醇醇沉除杂蛋白、多糖，浓缩成醇浸膏。用5ml热水温浸，充分混匀制成醇提物样品。取10μl稀释100倍用于对AChE抑制活性的筛选。

AChE活性检测方法以ATCh为底物、DTNB为显色剂,通过ATCh被AChE水解产生胆碱与DTNB反应，释放出黄色产物5-巯基-2-硝基本甲酸(5‘-mercapto-2‘-nitrobenzoicacid)来检测酶活性［5］。

AChE活性检测的基本操作过程［4］：在Eppendorf管中加入供试AChE粗提物、10mmol/LATCh，再加入mol/LPBS补平反应体系至390μl,混匀，恒温37℃孵育30min,加6％高氯酸10μl，振荡混匀，室温下终止反应20min，9184×g离心1min，取上清液，移入96孔板，每孔100μl，共计3孔，再加mmol/LDTNB100μl反应显色(整个反应体系为200μl)，酶标仪410nm［6］处检测OD值。

AChE体外酶促反应条件的优化［7］

磷酸缓冲溶液pH的确定配制mol/LPBS3次重复，其它条件同“”项所述，进行检测。

反应温度的确定将酶标仪检测温度分别设定为27，32，37，42，47℃，3次重复，其它条件同“”项所述，进行检测。

底物ATCh浓度的确定改变底物浓度，观察不同浓度时AChE的活性，选择最合适的底物浓度。

AChE粗提物用量的确定改变AChE粗提物的不同用量，确定酶促一级反应所用的粗提酶量范围。

蛇足石杉内生真菌发酵产物对AChE抑制活性的筛选

内生真菌发酵液醇提物样品的活性初筛发酵液醇提物样品稀释100倍后，取150μl加入反应体系中进行检测，设为OD样品。每个醇提物样品都设一对应样品本底色，即不加底物，其他反应条件与供试样品一致，同上检测，设为OD本底。阴性对照用PBS代替醇提物样品，使酶促过程在没有抑制剂的作用下彻底进行，同上检测，设为OD阴性。阳性对照不加底物，其他反应条件同阴性对照，用以模拟AChE失活或完全被抑制，其他同上检测，设为OD阳性。3次重复，取平均值。设AChE