传统法糯米酒乳酸菌筛选及发酵特性解析.docxVIP

传统法糯米酒乳酸菌筛选及发酵特性解析

一、引言

（一）研究背景与意义

糯米酒，作为我国传统发酵饮品中的瑰宝，拥有悠久的酿造历史，深受广大消费者的喜爱。其酿造过程涉及多种微生物的协同作用，而乳酸菌在其中扮演着关键角色。在糯米酒的发酵进程中，乳酸菌能够产生乳酸等有机酸，赋予米酒独特的酸味，同时调节发酵环境的pH值，为其他有益微生物的生长创造适宜条件，提升酒体的稳定性。乳酸菌在代谢过程中还会生成乙醛、双乙酰等挥发性物质，这些物质相互交织，共同塑造了糯米酒复杂而迷人的香气。

然而，当前针对糯米酒中乳酸菌的研究尚不够系统和深入。传统的糯米酒酿造技术主要依赖于酿酒师傅的经验，缺乏明确统一的标准，导致不同批次的产品质量参差不齐，难以满足大规模工业化生产的需求。因此，深入研究糯米酒中的乳酸菌，筛选出性能优良的菌株，并全面解析其发酵特性，对于提升传统酿造工艺的标准化水平，以及提高糯米酒产品的品质和稳定性，具有重要的理论和实践价值。通过本研究，有望为糯米酒酿造产业的现代化发展提供有力的技术支持，推动这一传统产业焕发出新的生机与活力。

（二）研究目标

本研究聚焦于传统法酿造的糯米酒，旨在从其中成功分离出乳酸菌，并构建一套高效的筛选体系，精准筛选出具有优良性能的乳酸菌菌株。深入探究关键菌株的发酵特性，全面解析其在发酵过程中的生长规律、代谢产物的生成情况以及对糯米酒品质的具体影响，明确其代谢规律。通过上述研究，为优化糯米酒的酿造工艺提供坚实的理论依据，助力实现传统糯米酒酿造工艺的现代化升级，提升产品品质，推动糯米酒产业的可持续发展。

二、材料与方法

（一）样品采集与乳酸菌分离筛选

样品来源：为全面涵盖自然发酵过程中的微生物多样性，本研究广泛采集了不同地域的传统糯米酒样品及酒曲。其中包括具有独特酿造工艺和地域风味的云南糯米酒，以及因气候和原料差异而呈现出不同发酵特点的黑龙江糯米酒。同时，针对每个采样点，分别在糯米酒发酵的前期、中期和后期进行样品采集。前期样品有助于获取发酵初始阶段活跃的乳酸菌，中期样品能反映发酵过程中乳酸菌的优势菌种及代谢变化，后期样品则可用于研究乳酸菌在发酵完成阶段的作用及稳定性。通过这样的多地域、多阶段采样策略，确保了所采集样品的丰富性和代表性，为后续乳酸菌的分离筛选提供了充足的样本基础。

分离纯化方法：采用含有碳酸钙的MRS培养基，利用乳酸菌产酸可溶解碳酸钙，从而在菌落周围形成透明圈的原理，对样品进行梯度稀释涂布。将采集的糯米酒样品或酒曲悬液进行10倍系列梯度稀释，如稀释至10^{-6}、10^{-7}等，取合适稀释度的菌液0.1ml均匀涂布于MRS-碳酸钙培养基平板上。将涂布后的平板置于37℃恒温培养箱中培养48h，此时产酸的乳酸菌周围会出现明显的溶钙圈。挑选出溶钙圈清晰、较大的菌落，采用平板划线法进一步纯化。将挑取的菌落接种到新的MRS培养基平板上，通过多次划线，使菌落逐渐分散，最终获得单菌落。对分离得到的单菌落进行革兰氏染色，乳酸菌为革兰氏阳性菌，在显微镜下呈现紫色；同时进行接触酶试验，乳酸菌接触酶试验为阴性，不产生气泡。通过这两项试验，初步筛选出疑似乳酸菌菌株。

分子鉴定技术：采用常规的细菌基因组DNA提取试剂盒，对初步筛选得到的疑似乳酸菌菌株进行基因组DNA提取。以提取的DNA为模板，使用细菌16SrRNA基因通用引物进行PCR扩增。引物序列如27F（5-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3）和1492R（5-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3），PCR反应体系和条件按照常规优化后的参数进行，如反应体系包含模板DNA、上下游引物、dNTPs、TaqDNA聚合酶和缓冲液等，反应条件为95℃预变性5min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环；最后72℃延伸10min。将扩增得到的16SrRNA基因序列进行测序，测序结果在NCBI数据库中进行BLAST比对分析。通过与数据库中已知乳酸菌序列的相似性比较，确定分离菌株的种属。若与植物乳杆菌已知序列相似性高达99%以上，则可鉴定为植物乳杆菌；若与米酒乳杆菌序列相似性匹配度高，则鉴定为米酒乳杆菌等。

（二）发酵特性研究方法

生长特性分析：将筛选鉴定后的乳酸菌菌株分别接种到以糯米汁为基础配制的培养基中，接种量为2%（v/v）。在30℃恒温条件下振荡培养，每隔2h取适量菌液，用紫外可见分光光度计在600nm波长处测定其OD值，以未接种的糯米汁培养基作为空白对照。以培养时间为横坐标，OD600nm值为纵坐标，绘制生长曲线。通过生长曲线分析菌株的对数生长期，即OD值呈指数增长的阶段，以及最大生物量，即