菊花转录组测序驱动下DgWRKY2基因克隆及转基因植株耐盐性深度剖析.docxVIP

菊花转录组测序驱动下DgWRKY2基因克隆及转基因植株耐盐性深度剖析

一、引言

1.1研究背景与目的

土壤盐渍化是一个全球性的生态问题，严重影响着农业生产和生态环境。据统计，全球约有10亿公顷的盐渍化土壤，占陆地面积的7%，且面积仍在不断扩大。盐胁迫对植物的生长发育产生多方面的负面影响，包括抑制种子萌发、阻碍根系生长、影响光合作用、破坏离子平衡等，进而导致作物产量大幅下降，严重威胁着全球粮食安全。因此，深入研究植物的耐盐机制，培育耐盐植物品种，对于提高盐碱地的利用效率、保障农业可持续发展具有至关重要的意义。

菊花（ChrysanthemummorifoliumRamat.）作为世界著名的观赏花卉之一，具有极高的观赏价值和经济价值，在园林景观、切花生产、药用保健等领域广泛应用。然而，菊花在生长过程中也常受到盐胁迫的影响，盐渍化土壤会导致菊花生长不良、花朵品质下降，严重制约了菊花产业的发展。因此，提高菊花的耐盐性成为菊花育种和栽培中的重要研究方向。

转录组测序技术的出现，为研究植物在盐胁迫下的基因表达调控机制提供了有力工具。通过转录组测序，可以全面、快速地获取植物在特定条件下的基因表达信息，挖掘与耐盐相关的关键基因。WRKY基因家族是植物中最大的转录因子家族之一，在植物的生长发育、生物和非生物胁迫响应等过程中发挥着重要作用。其中，DgWRKY2基因作为WRKY家族的成员，可能在菊花的耐盐性调控中扮演关键角色。

本研究旨在通过菊花转录组测序，克隆DgWRKY2基因，并对其进行功能验证，分析转基因植株的耐盐性，揭示DgWRKY2基因在菊花耐盐调控中的作用机制，为菊花耐盐品种的选育提供理论依据和基因资源，推动菊花产业在盐碱地区的可持续发展。

1.2国内外研究现状

近年来，随着高通量测序技术的飞速发展，转录组测序在菊花研究中得到了广泛应用。国内外学者利用转录组测序技术，对菊花的花色、花型、花期、抗逆性等重要性状相关的基因进行了挖掘和分析。例如，通过对不同花色菊花品种的转录组测序，鉴定出了多个与花色形成相关的结构基因和调控基因；对不同花期菊花品种的转录组分析，揭示了菊花花期调控的分子机制。在菊花耐盐性研究方面，转录组测序也为筛选耐盐相关基因提供了重要手段。通过对盐胁迫下菊花转录组的分析，发现了一系列差异表达基因，这些基因涉及离子转运、渗透调节、抗氧化防御等多个耐盐相关的生物学过程。

WRKY基因家族在植物中的研究较为深入。自1994年首次在甘薯中发现WRKY转录因子以来，目前已在多种植物中鉴定出大量的WRKY基因。研究表明，WRKY基因家族成员在植物的生长发育过程中发挥着重要作用，如参与种子萌发、根系发育、叶片衰老、开花调控等。在植物应对生物胁迫方面，WRKY基因能够响应病原菌的侵染，通过调控防御相关基因的表达，激活植物的防御反应，增强植物的抗病性。在非生物胁迫响应中，WRKY基因参与了植物对干旱、高温、低温、盐胁迫等多种逆境的应答过程。例如，在拟南芥中，AtWRKY25和AtWRKY33基因在盐胁迫下表达上调，过表达这两个基因能够提高拟南芥的耐盐性；在水稻中，OsWRKY71基因通过调控离子转运和抗氧化酶活性，增强水稻对盐胁迫的耐受性。

然而，目前关于菊花中DgWRKY2基因的研究相对较少。虽然已有研究报道了一些菊花WRKY基因在耐盐性中的作用，但对于DgWRKY2基因的克隆、功能分析及其在菊花耐盐调控中的分子机制仍有待深入研究。现有的研究主要集中在基因的表达分析和初步功能验证，对于其上下游调控关系、与其他耐盐相关基因的互作机制等方面还缺乏系统的研究。因此，深入开展DgWRKY2基因的研究，对于全面揭示菊花的耐盐分子机制具有重要意义。

1.3研究方法与技术路线

本研究采用了多种实验方法，主要包括：利用转录组测序技术对盐胁迫下的菊花进行测序，分析差异表达基因，筛选出DgWRKY2基因；通过基因克隆技术，从菊花基因组中扩增DgWRKY2基因，并构建植物表达载体；采用农杆菌介导的遗传转化方法，将DgWRKY2基因导入菊花中，获得转基因植株；对转基因植株进行耐盐性鉴定，分析其在盐胁迫下的生长状况、生理指标和基因表达变化，以评价其耐盐性；运用生物信息学方法，对DgWRKY2基因的序列特征、结构特点、进化关系等进行分析，预测其功能。

技术路线如下：首先，选取耐盐性不同的菊花品种，进行盐胁迫处理，采集处理后的叶片样品。提取样品的总RNA，进行转录组测序。对测序数据进行质量控制和分析，筛选出在盐胁迫下差异表达的基因，重点关注WRKY基因家族成员，从中确定DgWRKY2基因。根据转录组测序结果，设计特异性引物，以菊花基因组DNA为模板，通过PCR扩