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解析二化螟中肠氨肽酶-N（CsAPN1）原核表达及与Bt毒素结合奥秘

一、引言

1.1研究背景

水稻（OryzasativaL.）作为世界上最重要的粮食作物之一，是全球一半以上人口的主食，在保障粮食安全方面发挥着举足轻重的作用。据统计，全球有超过30亿人以水稻为主食，其种植范围广泛，涵盖亚洲、欧洲、热带美洲及非洲部分地区，在我国主要种植在华南地区。然而，水稻在生长过程中面临着诸多病虫害的威胁，其中二化螟（Chilosuppressalis，Walker）是对水稻危害最为严重的常发性害虫之一。

二化螟，又称钻心虫、蚌杆虫、亚洲水稻螟、条纹水稻螟，属于鳞翅目螟蛾科。其在中国分布广泛，尤其在北方稻区较为常见。二化螟食性广泛，除了水稻，还危害小麦、玉米、高粱、油菜等作物以及稗草、芦苇、稻李氏禾等杂草。二化螟的幼虫会蛀入水稻茎内，在水稻的不同生长阶段造成不同的危害症状。在分蘖期，幼虫蛀入导致水稻出现“枯鞘”“枯心苗”；在穗期，会造成“死孕穗”“白穗”等症状，严重影响水稻的产量和质量。一般年份，二化螟危害可导致水稻减产3%-5%，严重时减产可达3成以上。近年来，随着气候异常变化、耕作制度改变以及水稻品种结构的调整，二化螟的发生危害呈加重趋势，给水稻生产带来了巨大挑战。

为了有效控制二化螟的危害，传统的防治方法主要依赖化学农药。然而，长期大量使用化学农药不仅导致二化螟抗药性不断增强，防治效果逐渐下降，还带来了环境污染、农产品质量安全等一系列问题，对生态平衡和人类健康造成了潜在威胁。因此，寻找一种绿色、高效、可持续的防治方法迫在眉睫。

转基因抗虫水稻的出现为解决这一问题提供了新的途径。通过将苏云金芽孢杆菌（Bacillusthuringiensis，Bt）的杀虫晶体蛋白基因导入水稻基因组，使水稻自身能够表达具有杀虫活性的蛋白，从而对二化螟等鳞翅目害虫产生抗性。Bt毒素作为一种生物杀虫剂，具有对靶标害虫特异性强、对人畜安全、环境友好等优点，在农业害虫防治中得到了广泛应用。目前，已有多种Bt转基因抗虫水稻品种进入田间试验和商业化种植阶段，为水稻害虫防治带来了新的希望。

但是，随着Bt转基因抗虫水稻的大规模种植，靶标害虫对Bt毒素产生抗性的问题逐渐凸显。研究表明，昆虫对Bt毒素产生抗性的机制较为复杂，涉及多个方面，其中中肠受体蛋白的变异是导致抗性产生的重要因素之一。氨肽酶-N（aminopeptidaseN，APN）作为Bt毒素的重要受体之一，在Bt毒素与昆虫中肠细胞的相互作用过程中发挥着关键作用。APN的变异可能会影响Bt毒素与受体的结合能力，从而降低Bt毒素的杀虫活性，导致昆虫对Bt产生抗性。因此，深入研究二化螟中肠氨肽酶-N（CsAPN1）与Bt毒素的结合特性，对于揭示二化螟对Bt毒素的抗性机制，制定有效的抗性治理策略具有重要的理论和实践意义。

1.2Bt毒素作用机理

1.2.1成孔模型

Bt毒素的成孔模型是目前被广泛接受的一种作用机制。当敏感昆虫取食含有Bt毒素的食物后，Bt毒素晶体在昆虫碱性的中肠环境中溶解，释放出原毒素。原毒素在中肠蛋白酶的作用下，被酶解激活，形成具有活性的毒素片段。这些活性毒素片段能够与中肠上皮细胞刷状缘膜囊（BBMV）上的特异受体结合，随后，毒素分子发生构象变化，部分或全部插入细胞膜，形成孔洞。一般认为，毒素分子的结构域Ⅰ在这一过程中起关键作用，其中α-螺旋束可能是形成孔洞的主要结构单位。当多个毒素分子寡聚化后，在细胞膜上排列形成一个亲水离子通道，使得细胞内的离子和小分子物质外流，细胞外的水分内流，导致细胞渗透裂解，最终昆虫因中肠细胞受损、生理功能紊乱而死亡。

1.2.2信号转导模型

信号转导模型认为，Bt毒素与受体结合后，能够引发细胞内一系列的信号传导事件，从而导致昆虫死亡。具体来说，当活性毒素与中肠膜受体结合后，激活了G蛋白和腺嘌呤环化酶，使细胞内cAMP水平升高，进而激活蛋白激酶A。蛋白激酶A的激活会引发一系列的磷酸化反应，影响细胞内多种蛋白质的功能，导致细胞代谢紊乱、凋亡等，最终致使昆虫死亡。此外，还有研究表明，Bt毒素可能通过激活其他信号通路，如丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）信号通路等，来影响细胞的生理功能。在这一模型中，毒素与受体的结合是触发信号传导的关键步骤，不同的受体可能激活不同的信号通路，从而导致细胞死亡的具体机制也有所差异。

1.2.3共同作用模型

越来越多的研究表明，Bt毒素的杀虫作用可能并非单一的成孔模型或信号转导模型所能解释，而是两种机制共同作用的结果。在实际过程中，毒素与受体结合后，一方面可能通过形成孔洞破坏细胞的渗透平衡，另一方面也可能引