第十章 核酸分子杂交.pptVIP

第十章核酸分子杂交（nucleicacidhybridization）概念：具有序列互补的两条单链在一定条件下形成双链的过程利用已知核酸序列(即探针)检测与其互补的特定未知核酸序列的方法用途：对特定核酸序列进行定量。确认核酸序列间同源性。探测含量极低的特定核酸序列。第一节分子杂交的基本原理变性复性杂交一、核酸变性概念：在特定变性因素作用下，DNA双螺旋解离的过程。破坏氢键与疏水作用可导致变性。热变性：高温可使核酸变性。温度高于90℃时任何核酸双链都将变性。酸碱变性：pH3或pH11时核酸将变性，DNA使用碱变性，RNA则不可。化学试剂变性：能够破坏氢键的化学试剂如尿素或甲酰胺可使核酸变性。复性温度Tm：解链温度或变性温度。影响变性温度的因素：溶液的离子强度。变性温度与离子强度成正相关。DNA分子的GC含量。GC％＝(Tm－69.3)×2.24二、核酸复性变性的DNA单链相互识别并结合，恢复其天然双螺旋结构的过程。复性类似与化学反应，需要一定反应时间。影响DNA复性速度的因素DNA分子的长度和浓度：长片段复性速度慢；浓度高，复性快探针长度：50-300bp；双链探针：0.1-0.5ugDNA分子的复杂性：重复序列复性速度快。温度：一般复性温度为Tm-25;温度更高，双链趋向解链杂交体的稳定性：RNA/RNARNA/DNADNA/DNA碱基的错配：1个碱基－－1-1.5度寡核苷酸探针：Tm-5离子强度：离子浓度高低影响杂交反应低浓度，杂交慢；高浓度，严谨性降低杂交液的甲酰胺：优点：使探针在低温下更稳定；更好保留非共价结合的核酸水溶液－－68度；甲酰胺－－42度核酸分子的复杂性：复杂性：反应体系中不同顺序的总长度C0t1/2与反应体系核酸复杂性成正比非特异杂交反应SalmonspermDNACalfthymusDNA封闭液：denhardt或脱脂奶粉第二节

核酸杂交的基本方法

Southern印迹杂交（Southernblotting)1975年爱丁堡Southern概念：结合电泳技术的杂交方法，用于DNA和DNA之间的杂交，被检测的DNA转印并结合在固相支持物，用标记的DNA为探针，可显示靶DNA序列的长度。SouthernBlotting基本步骤待测样品的制备genomicDNA部分酶切消化上样待测样品的电泳分离AGE:0.8-1%;70-80kbMarker:DNA片段长度的参照基因组重排的研究：生殖细胞genomicDNA凝胶中核酸的变性电泳后，转膜前，碱变性转膜方法：毛吸管转移:利用浓盐转移缓冲液的推动作用，将凝胶中DNA转移到固相支持物上缺点：转移效率不高，优点：简单，价廉电转移：通过电泳作用将凝胶DNA转移到滤膜上优点：效率高缺点：不能用硝酸纤维膜；不能用高盐转移缓冲液；必须用循环冷却水装置真空转移：真空装置优点：快缺点：特殊仪器探针的制备：DNA、RNA、寡核苷酸标记方式：可核素或非核素杂交：预杂交杂交杂交结果的检测：取决于探针标记的方式应用：克隆基因的酶切图谱分析特定基因的定量及定性基因突变分析RFLP二、RNA的杂交Northern印迹杂交：类似于Southern印迹杂交的方法。斑点杂交：将RNA样品直接点在杂交膜上，而不进行电泳分离。反Northern杂交：将探针DNA片段固定在杂交膜上，利用标记物标记的总RNA进行杂交。反Northern杂交与DNA芯片四、原位杂交原位杂交(insituhybridization)是检测特定基因在染色体的分