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高通量基因测序技术工作规范

一、前言

高通量基因测序技术（High-ThroughputSequencing,HTS）作为生命科学研究与临床应用的关键工具，其结果的准确性、可靠性与可重复性直接依赖于标准化的操作流程与严格的质量控制。本规范旨在为从事高通量基因测序相关工作的实验室及技术人员提供一套通用的技术指导原则，以确保测序过程的规范性、数据质量的稳定性，并最大限度降低实验误差与潜在风险。本规范适用于基于高通量测序平台的各类基因测序实验，包括但不限于全基因组测序、全外显子组测序、转录组测序、靶向捕获测序等。

二、样本管理

2.1样本接收与登记

样本接收时，需由专人负责，仔细核对样本信息与送检单的一致性，包括样本编号、来源、类型、采集日期、保存条件及检测项目等。对于信息不全、标识不清、疑似污染或质量不符合要求的样本，应及时与送样方沟通，必要时予以拒收。所有接收样本均需详细登记于实验室样本管理系统，建立唯一可追溯的样本编号。

2.2样本保存与运输

样本应按照其特性及后续实验要求进行适当的保存。常用保存方式包括低温冷冻（-20℃或-80℃）、液氮保存或特定保存液保存等。保存过程中应避免反复冻融。样本运输需使用符合生物安全要求的运输容器，确保样本在运输过程中的稳定性与安全性，并符合相关生物安全运输规定。

2.3样本前处理

样本前处理（如DNA/RNA提取）是保证测序质量的关键步骤。应根据样本类型（如血液、组织、细胞、FFPE样本等）选择经过验证的、高效稳定的提取方法与商品化试剂盒。实验操作需严格按照标准操作规程（SOP）进行，确保提取效率与核酸质量。提取后的核酸样本应进行浓度、纯度及完整性检测，只有符合质量标准的核酸才能进入后续文库制备环节。

三、文库制备

3.1试剂准备与管理

文库制备所用试剂应选择质量可靠、批次稳定的产品。试剂到货后应核对品名、规格、批号、有效期等信息，并按照说明书要求的条件妥善储存。实验前，需检查试剂是否在有效期内，是否有变质、沉淀等异常现象。对于需要分装的试剂，应在无菌条件下进行，并做好标识。

3.2文库构建操作

文库构建过程应在洁净、无污染的实验环境中进行，最好在生物安全柜或超净工作台内操作。操作人员需严格遵守无菌操作规范，佩戴一次性手套、口罩及实验服，避免交叉污染。关键步骤如DNA片段化（超声、酶切等）、末端修复、加A、接头连接、PCR扩增等，均需严格按照既定SOP及试剂说明书进行，精确控制反应体系、温度、时间等参数。操作过程中，应设立阴性对照（如无模板对照）和阳性对照（如已知浓度的标准品），以监控实验过程是否存在污染及试剂有效性。

3.3文库质量控制

文库制备完成后，需对其浓度、片段大小分布及纯度进行严格检测。常用方法包括荧光定量PCR（QPCR）检测文库浓度，毛细管电泳或琼脂糖凝胶电泳分析片段大小分布。只有浓度达标、片段分布符合预期、无明显引物二聚体或杂峰的文库方可用于后续测序。

四、测序运行

4.1测序仪准备

测序前，需确保测序仪处于良好运行状态。定期对仪器进行维护保养，包括清洁、校准等。检查测序所需的耗材，如流动槽（FlowCell）、试剂cartridge等是否齐全，并确认其有效期及储存条件符合要求。根据测序类型和读长要求，正确安装流动槽和试剂，进行仪器初始化和自检。

4.2文库加载与测序运行

按照仪器操作规程，将合格的文库进行稀释、变性（如需要），并准确加载至测序仪。设置正确的测序参数，如测序模式、读长、循环数等。启动测序程序后，应密切监控仪器运行状态，包括流体系统、光学系统、温度控制等关键模块的工作情况，以及实时产生的测序数据质量指标。

4.3测序过程监控与数据初步评估

测序过程中，需定期查看仪器运行日志和数据质量报告，关注簇密度、Q30比例、错误率等关键指标。如发现异常情况，应及时分析原因并采取相应措施，必要时中止测序。测序运行结束后，仪器会自动生成原始图像数据并进行碱基识别（BaseCalling），得到原始测序数据（RawData）。

五、数据分析与报告

5.1原始数据处理

原始测序数据通常以FASTQ格式存储。首先应对原始数据进行初步的质量评估，包括碱基质量分布、序列长度分布、GC含量、接头污染情况等。根据评估结果，进行必要的数据过滤和预处理，如去除低质量reads、含接头序列的reads、过短或过长的reads等，以获得高质量的cleandata。

5.2数据分析

根据不同的测序项目需求，选择合适的生物信息学分析流程和软件。分析流程应经过验证，确保其准确性和可靠性。数据分析通常包括序列比对（Mapping）、变异检测（如SNP、InDel、CNV、SV等）、注释、功能富集分析等步骤。对于临床检测项目，数据分析需严格遵循相关的临床解读标准和指南。在