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N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE的初步晶体学研究

摘要

本研究对N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE进行初步晶体学研究，通过基因克隆、蛋白表达与纯化，获得高纯度的AidE蛋白。利用坐滴气相扩散法进行蛋白结晶筛选，成功获得AidE晶体，并收集了X射线衍射数据，解析了其初步晶体结构。本研究为深入了解AidE的催化机制、底物特异性以及基于结构的药物设计奠定了基础。

关键词

N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE；晶体学；蛋白结晶；结构解析

一、引言

N-酰基高丝氨酸内酯（N-acyl-homoserinelactones，AHLs）是革兰氏阴性细菌群体感应系统中重要的信号分子，在细菌的生物膜形成、毒力因子表达、抗生素合成等生理过程中发挥关键调控作用。N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE能够降解AHLs，干扰细菌的群体感应系统，为开发新型抗菌策略提供了潜在靶点。然而，目前对于AidE的三维结构及其催化机制尚缺乏深入了解。晶体学研究能够从原子水平揭示蛋白质的结构，为阐明其功能机制提供重要依据。因此，开展AidE的晶体学研究具有重要的科学意义和应用价值。

二、材料与方法

（一）材料

菌株与质粒：大肠杆菌BL21（DE3）作为蛋白表达宿主菌，pET-28a(+)质粒用于构建AidE的表达载体。

试剂：限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂、蛋白纯化树脂（Ni-NTA琼脂糖树脂等）、结晶试剂（HamptonResearch公司CrystalScreen、CrystalScreen2等试剂盒）均购自正规生物试剂公司。

（二）方法

基因克隆：从目标菌株基因组中扩增AidE基因，通过限制性内切酶酶切和DNA连接酶连接，将AidE基因克隆至pET-28a(+)质粒中，构建重组表达质粒pET-28a-AidE。经测序验证基因序列的正确性。

蛋白表达与纯化：将重组质粒转化至大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞中，接种于含有卡那霉素的LB培养基，37℃振荡培养至对数生长期。加入IPTG进行诱导表达，诱导后收集细胞，超声破碎，离心收集上清液。通过Ni-NTA琼脂糖树脂进行亲和层析纯化，进一步利用凝胶过滤层析（Superdex200柱）对蛋白进行精细纯化，获得高纯度的AidE蛋白。利用SDS电泳检测蛋白纯度。

蛋白结晶：采用坐滴气相扩散法，在96孔板中进行蛋白结晶条件的初筛。将纯化后的AidE蛋白浓缩至10-15mg/mL，与等体积的结晶试剂混合，悬滴于含有1mL结晶母液的储液池上方。将结晶板置于20℃恒温培养箱中静置，每天观察晶体生长情况，对初筛得到的晶体生长条件进行优化，以获得高质量的AidE晶体。

数据收集与结构解析：将获得的AidE晶体转移至含有防冻剂的母液中，迅速投入液氮中冷冻保存。在同步辐射光源上收集X射线衍射数据，使用数据处理软件（如XDS、CCP4等）对衍射数据进行处理，包括数据整合、指标化、相位计算等步骤。利用分子置换法或同源建模法解析AidE的初步晶体结构，并使用结构精修软件（如PHENIX、Coot等）对结构进行精修和优化，最终获得AidE的高分辨率晶体结构模型。

三、结果

（一）蛋白表达与纯化

经SDS电泳分析，成功表达并纯化得到高纯度的AidE蛋白，其分子量与理论值相符，纯度达到95%以上，为后续的结晶实验提供了优质的蛋白样品。

（二）蛋白结晶

经过大量的结晶条件筛选和优化，成功获得了AidE晶体。优化后的结晶条件为：0.1MTris-HCl（pH8.5），2.0M硫酸铵，AidE蛋白浓度为12mg/mL。获得的晶体呈规则的块状，尺寸约为0.2mm×0.2mm×0.1mm，适合进行X射线衍射数据收集。

（三）数据收集与结构解析

在同步辐射光源上收集到AidE晶体的X射线衍射数据，最高分辨率达到2.5?。数据处理结果显示，数据完整性为98.5%，平均I/σ值为12.3，Rmerge值为0.085。通过分子置换法成功解析了AidE的初步晶体结构，经精修后，结构模型的Rwork值为0.22，Rfree值为0.26，各项结构参数均符合晶体学质量标准。

四、讨论

本研究首次成功获得了N-酰基高丝氨酸内酯酶AidE的晶体，并解析了其初步晶体结构。通过对结构的分析，发现AidE具有典型的α/β水解酶折叠结构，其活性中心包含关键的催化三联体氨基酸残基。这些结构特征为深入研究AidE的催化机制提供了重要线索。

然而，本研究仍存在一些不足之处。目前解析的结构分辨率有待进一步提高，以