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聚合酶链式反应技术及其应用
提纲
第一节聚合酶链式反应扩增原理
第二节PCR反应体系和循环参数的优化
第三节PCR反应的问题与对策
第四节一个常规PCR实验的设计
第五节聚合酶链式反应技术类型
第六节聚合酶链式反应技术应用
第七节实时荧光定量PCR技术的原理及应用
聚合酶链反应
(PolymeraseChainReaction,PCR)
聚合酶链反应(polymerasechainreaction,PCR)是近
十几年来发展和普及最迅速的分子生物学新技术之一。由于
它具有强大的扩增能力，并且可与其他分子生物学方法(如核
酸杂交)和免疫学方法(如ELISA)相结合应用，使其敏感性和
特异性都大大增强，因而广泛地应用于生物医学领域的各个
学科，包括基因的克隆、修饰、改建、构建cDNA文库，遗
传病，传染病的诊断，法医学鉴定，物种起源，生物进化分
析，流行病学调查，等等。由于PCR对世界生物医学研究的
巨大推动作用，其发明者Mullis因而获得1992年诺贝尔医学
奖。
最早报道的PCR是用大肠杆菌DNA聚合酶I
经枯草杆菌蛋白酶处理后获得的Klenow片段来
催化DNA链的延伸。由于加热变性时酶会失活，
需要补加一份酶催化下一轮合成。这样不仅操
作复杂，而且由于酶反应的温度较低，DNA分子
会产生二级结构或引物非特异退火，使反应效
率低且易出现非特异性产物，同时，会增加污
染的机会。耐热DNA聚合酶的应用使PCR得以完
善。这种酶在加热95℃时不会变性，引物退火
和链的延伸可以在较高的温度下进行，因而使
得PCR的产率和特异性都大大提高。
PCR技术问世后，不仅迅速在生物医学领域得到广
泛应用，而且不断衍生出许多新的技术，使其应用范围
不断扩大，特异性和敏感性也不断提高。
比如反转录PCR(RT-PCR)是以mRNA为模板，通过
反转录反应合成cDNA,再做PCR扩增，因而可检测特异
的mRNA或得到其cDNA克隆；
如果仅有很少的序列资料，可通过锚式PCR对RNA
进行分析；
差异显示PCR(DD-PCR)可以鉴定和分离在不同条
件下(如机体或细胞受某种刺激或疾病时)某些有表达差异
的基因，而无需确切的序列资料；
免疫PCR是将PCR的强大扩增效力应用于免疫学检测
中，与传统方法相比其灵敏性要提高几个数量级；
PCR-ELISA则是将PCR与核酸杂交、ELISA连为一
体，用ELISA鉴定PCR产物，避免了因使用Southern
Blotting所带来的放射性污染等等。
第一节聚合酶链式反应扩增原理
PCR是利用耐热DNA聚合酶在体外条件下，
催化一对引物间的特异DNA片段合成的
基因体外扩增技术。它包括三个基本过程：
第一步加热变性
模板DNA经94℃左右加热一定时间后，双链DNA
解离成为单链。
第二步引物与靶序列退火
模板DNA经加热变性成单链后，把温度降至55℃
左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合。
第三步引物延伸
3
靶序列
,
5’5
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