基因工程 基因文库的构建.pptVIP

第1页，共38页，星期日，2025年，2月5日Genelibrary(Genomiclibrary)：Acollectionofindependentclonesrepresentingtheentiregenomeofanorganism.FirststeptoisolateatargetDNAsequencefromanorganism’sgenome.第2页，共38页，星期日，2025年，2月5日1976L.Clark,J.Carbonn=ln(1-p)/ln(1-f)n:numbersofrecombinantrequiredinfulllibraryp:probabilityoftargetgeneinlibraryf:rateofaverageinsertionDNAsizestogenome第3页，共38页，星期日，2025年，2月5日Mammal3×109bpIfp=99%clonedfragment20kbf=20kb/3×109n=690773.2E.coli4639221bpp=99%f=20kb/4600kbn=1056.9p=99%f=10kb/4600kbn=2116第4页，共38页，星期日，2025年，2月5日cDNAlibrary:AcollectionofindependentclonesrepresentingtheentirecDNAreverselytranscriptedfrommRNAinaspecifictissueofanorganisminaspecificphage.第5页，共38页，星期日，2025年，2月5日BacterialcoloniesconsistingofgenomicDNAlibrary第6页，共38页，星期日，2025年，2月5日ChoosingvectorStepsoflibraryconstructionPlasmid10kb?Phage0-23kbCosmid~45kbBAC~100kb（250-300kb?）YAC~300kb-1.2Mb第7页，共38页，星期日，2025年，2月5日SUP4基因：酵母细胞Trp-tRNA基因的赭色突变抑制基因，含有克隆位点。在发生Ade2-赭色突变的宿主细胞中，如果没有外源基因的插入，则突变基因表达受抑制受体菌为Ade+，形成白色菌落；当有外源基因插入时，SUP4表达将被阻断，抑制作用被消除，受体菌为Ade-，菌落为红色。第8页，共38页，星期日，2025年，2月5日第9页，共38页，星期日，2025年，2月5日CosmidHalfof?phage.If?700000,cosmid350000(菌落数)CosmidisusuallyappliedinlargesizeDNAcloning,butitismuchmoredifficultthan?phage，becausethereisnomuchexperience.（pJB8andc2RBaremoreusedingenelibraryconstruction)第10页，共38页，星期日，2025年，2月5日?phagevector1970’s,likeCharon4Aand?gt-WES，15～20kbPresently,EMBLlines,like?2001，?DASH，Charon38-40，?GEM-11etc.(replacementvectors),20-24kb第11页，共38页，星期日，2025年，2月5日Basicprinciplesinchoosing?vectorEasilyrecoverforeignDNAfrom?;Easilyprepare2arms;Availabilityofvectorsequence,REmapping;Ambermutation(琥珀突变