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雷帕霉素联合顺铂对人骨肉瘤细胞作用机制的深度剖析

一、引言

1.1研究背景

骨肉瘤是一种原发性恶性骨肿瘤，好发于10-20岁的青少年，发病高峰年龄在15岁左右，且男性略多于女性。其好发部位多为长骨干骺端，如股骨远端、胫骨近端和肱骨近端等。骨肉瘤的恶性程度极高，具有很强的侵袭性和转移性。早期症状通常表现为局部疼痛，起初多为间断性隐痛，随着病情进展，疼痛会逐渐加剧，发展为持续性剧痛，且夜间更为明显，严重影响患者睡眠与日常生活。随着肿瘤生长，局部还会出现肿块，肿块质地坚硬，边界不清，伴有压痛，皮肤温度升高，表面可见怒张的血管。骨肉瘤不仅会导致局部疼痛、关节活动受限，还极易引发病理性骨折，增加患者痛苦并加重病情。更为严重的是，骨肉瘤细胞容易通过血液循环转移至肺部、肝脏等重要脏器，形成转移瘤，极大地增加了治疗难度，严重威胁患者生命健康，使患者生存率显著降低。

在二十世纪七十年代以前，受限于治疗手段，骨肉瘤单纯手术后的五年生存率仅为10%-20%。近年来，随着保肢手术结合基于甲氨蝶呤、顺铂、阿霉素、异环磷酰胺等的新辅助化疗方法在临床上的广泛应用，对于早期未发生肺转移的骨肉瘤患者，预后有了较大改善，术后5年生存率上升到50%-70%。然而，仍有多达30%的患者会发生肺转移，对于那些早期发生肺转移、对化疗药物不敏感以及术后复发的患者，现有的治疗方法效果不佳，预后情况不容乐观。因此，迫切需要探寻更为有效的治疗骨肉瘤的新方法，以提高患者生存率与生活质量。

1.2研究目的与意义

本实验旨在深入探究雷帕霉素联合顺铂对人骨肉瘤细胞增殖、凋亡等生物学行为的影响，并初步探讨其作用机制。通过细胞实验，对比雷帕霉素联合顺铂与单用雷帕霉素或单用顺铂对人骨肉瘤细胞的作用效果，明确联合用药是否具有协同增效作用。这一研究对于丰富骨肉瘤的治疗理论具有重要意义，能够为临床治疗骨肉瘤提供新的理论依据与治疗思路，有望为骨肉瘤患者带来更有效的治疗方案，提高患者的生存率与生活质量，具有潜在的临床应用价值。

1.3国内外研究现状

国外在骨肉瘤治疗研究方面起步较早，在化疗药物研发与联合治疗方案探索上取得了一定成果。在雷帕霉素治疗骨肉瘤的研究中，有学者发现雷帕霉素可以通过干预雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号途径，有效抑制骨肉瘤干细胞的增殖活性和成球特性，为雷帕霉素应用于骨肉瘤联合化疗提供了理论依据。对于顺铂，其作为骨肉瘤化疗的常用药物之一，作用机制主要是与DNA结合形成DNA-DNA和DNA-蛋白质交联物，阻碍DNA复制过程，从而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡。在联合治疗研究领域，有团队开展了多种药物联合治疗骨肉瘤的实验，试图寻找最佳联合治疗方案。

国内在骨肉瘤治疗研究方面也在不断深入。关于雷帕霉素，有研究表明其能显著抑制人骨肉瘤MG-63细胞增殖及细胞周期，下调MG-63细胞CyclinD1蛋白的表达。在顺铂治疗骨肉瘤研究中，发现顺铂能够诱导细胞周期的停滞，尤其是在细胞生长期时的停滞效应最为显著。在联合治疗方面，有研究比较了雷帕霉素联合顺铂与单用雷帕霉素或单用顺铂对人骨肉瘤细胞增殖和凋亡的影响，结果显示联合应用两种药物对人骨肉瘤的抑制率较单独使用明显增强，且诱导凋亡作用显著增强。

然而，当前关于雷帕霉素联合顺铂治疗人骨肉瘤细胞的研究仍存在一些不足。在作用机制研究方面，虽然知道雷帕霉素作用于mTOR信号途径、顺铂作用于DNA复制过程，但二者联合使用后在细胞内信号传导通路等方面的协同作用机制尚未完全明确。在临床应用研究方面，缺乏大规模临床试验验证联合用药的安全性与有效性，联合用药的最佳剂量、给药时间和疗程等也有待进一步探索。本研究将从细胞实验层面，深入研究雷帕霉素联合顺铂对人骨肉瘤细胞的作用效果与机制，弥补当前研究的部分不足，为后续临床研究奠定基础。

二、材料与方法

2.1实验材料

2.1.1细胞株

本实验选用人骨肉瘤143B细胞株，购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。143B细胞具有成骨细胞的部分特性，贴壁生长，增殖能力较强，常被用于骨肉瘤相关的细胞实验研究，能较好地模拟人骨肉瘤细胞的生物学行为，是研究骨肉瘤发病机制和治疗方法的常用细胞模型。

2.1.2主要试剂

雷帕霉素（纯度≥98%）购自Selleck公司，以无水乙醇溶解配制成10mmol/L的储存液，-20℃避光保存；顺铂（纯度≥99%）购自Sigma公司，用生理盐水溶解配制成1mg/mL的储存液，4℃保存。细胞培养基选用DMEM高糖培养基（含L-谷氨酰胺、酚红），购自Gibco公司；胎牛血清（FBS）购自杭州四季青生物工程材料有限公司；胰蛋白酶（0.25%，含EDTA）购自