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拟南芥miR319a超表达对矮牵牛形态塑造的分子机制探究

一、引言

1.1研究背景与目的

在植物的生长发育进程中，微小核糖核酸（microRNA，miRNA）扮演着至关重要的角色，它是一类内生的、长度约为21-24个核苷酸的非编码单链RNA分子。这些分子通过对靶基因mRNA的切割或者抑制其翻译过程，从而实现对基因表达的精准调控，这一调控过程广泛涉及植物生长发育的各个方面，包括但不限于种子萌发、根与叶的形态建成、花器官的发育以及果实的成熟等。在众多miRNA中，miR319a作为高度保守的成员之一，在植物界中普遍存在，并且参与了多种生物学过程的调控，其在植物生长发育调控网络里占据着关键地位。

矮牵牛（PetuniahybridaVilm），作为一种极具观赏价值的园林植物，其花型多样、花色丰富，广泛应用于花坛布置、盆栽观赏等领域，深受人们喜爱。矮牵牛不仅具有重要的观赏价值，而且由于其基因组相对较小、生长周期较短、易于转化等特点，使其成为研究植物基因功能和花发育机制的理想模式植物。通过对矮牵牛的研究，我们能够深入了解植物生长发育的分子机制，为花卉育种和园林应用提供坚实的理论基础。

本研究聚焦于超表达拟南芥miR319a对矮牵牛形态发育的影响，旨在深入探究miR319a在矮牵牛生长发育过程中的作用机制。一方面，通过研究miR319a对矮牵牛叶形态发育的影响，我们能够揭示miR319a在调控叶片大小、形状、表皮毛形成等方面的分子机制，为深入理解植物叶片发育的调控网络提供新的视角；另一方面，研究miR319a对矮牵牛花形态发育的影响，有助于我们明确miR319a在花器官分化、花瓣形态建成、花色形成等过程中的作用，为花卉分子育种提供关键的理论依据和技术支持。

1.2国内外研究现状

在过去的几十年里，国内外学者针对miR319a及矮牵牛形态发育开展了大量研究，并取得了一系列重要成果。在miR319a的研究方面，已明确其在多种植物中的生物合成途径和作用机制。研究发现，miR319a基因首先转录形成具有发夹结构的初级转录本（pri-miR319a），然后在Dicer-like1（DCL1）等酶的作用下，逐步加工生成成熟的miR319a。成熟的miR319a与AGO1等蛋白结合形成RNA诱导沉默复合体（RISC），通过碱基互补配对原则识别并结合靶基因mRNA，从而对靶基因进行切割或者抑制其翻译过程。

在矮牵牛形态发育的研究中，人们对其花器官发育的ABC模型有了较为深入的认识，即A类基因单独决定萼片的发育，A类和B类基因共同决定花瓣的发育，B类和C类基因共同决定雄蕊的发育，C类基因单独决定雌蕊的发育。此外，还发现了许多参与矮牵牛形态发育的关键基因和信号通路，如控制花色的查尔酮合成酶（CHS）基因家族，以及参与花器官发育调控的MADS-box基因家族等。

然而，现有研究仍存在一些不足之处。对于miR319a在矮牵牛中的具体作用机制，尤其是其对矮牵牛叶和花形态发育的调控机制，尚未完全明确。虽然已知miR319a能够靶向调控TCP基因家族，但在矮牵牛中，miR319a与TCP基因之间的相互作用关系以及它们如何协同调控矮牵牛形态发育的具体分子机制仍有待深入研究。此外，在矮牵牛的研究中，对于环境因素如何影响miR319a的表达以及其对矮牵牛形态发育的间接作用也关注较少，这为进一步深入研究miR319a在矮牵牛生长发育中的功能留下了广阔的空间。

1.3研究方法和创新点

本研究综合运用了多种先进的实验技术和方法。在基因克隆与载体构建方面，采用PCR技术从拟南芥基因组中克隆miR319a基因，并将其连接到植物超表达载体上，构建重组表达载体。利用农杆菌介导的遗传转化方法，将重组表达载体导入矮牵牛中，获得超表达miR319a的转基因矮牵牛植株。通过CTAB法抽提矮牵牛基因组DNA，利用RACE技术克隆矮牵牛PhTCP5和PhTCP6基因的全长cDNA序列，并进行生物信息学分析，以了解这些基因的结构和功能特征。

在基因表达分析方面，运用荧光定量PCR技术，对miR319a及其靶基因PhTCP5和PhTCP6在转基因矮牵牛不同组织和发育时期的表达水平进行定量分析，从而明确它们的时空表达模式。利用RLM-5’RACE技术验证miR319a对靶基因的剪切作用，进一步揭示miR319a的作用机制。

本研究的创新点主要体现在研究视角和方法应用两个方面。在研究视角上，首次系统地研究超表达拟南芥miR319a对矮牵牛叶和花形态发育的影响，将miR319a的研究从模式植