精选扩增和电泳检测讲义.pptVIP

（优选）扩增和电泳检测当前1页，总共31页。电泳观察PCR反应实验步骤当前2页，总共31页。DNA在体内复制的条件是什么？模板：酶：原料、能量：解旋酶、DNA聚合酶等。DNA分子的每条链dATP、dGTP、dCTP、dTTP引物：温和的反应条件当前3页，总共31页。DNA分子的结构当前4页，总共31页。合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸当前5页，总共31页。合成DNA分子的原料——脱氧核苷三磷酸dATPdGTPdCTPdTTP当前6页，总共31页。 聚合反应机理：当前7页，总共31页。DNA聚合酶当前8页，总共31页。不同细胞的细胞周期不同生物细胞需要的时间细菌一般是20~30分钟蚕豆根尖细胞17.3小时小鼠十二指肠细胞15.3小时人的肝细胞22小时人的宫颈癌细胞22.5小时PCR技术可在几小时内，将特定核酸序列扩增百万倍!当前9页，总共31页。PCR的概念PCR（PolymeraseChainReaction,聚合酶链反应）是指在体外，通过特异DNA引物扩增核酸分子中某个特定区域的技术。当前10页，总共31页。PCR的反应体系DNA模板原料：dNTP(dATP、dGTP、dCTP、TTP)；酶：Taq聚合酶（嗜热细菌中分离得到）引物：（单链DNA片段）Mg2+（维持酶活性所必需）PCR缓冲液：维持pH，保护Taq酶当前11页，总共31页。PCR技术原理变性退火延伸当前12页，总共31页。PCR三步曲预变性保温变性90~95℃延伸70~75℃退火40~60℃当前13页，总共31页。PCR仪当前14页，总共31页。用于PCR的预混液（500?L体系）：ddH2O310?L10×butter50?LMgCl240?LdNTP混合液20?L引物125?L引物225?L模板DNA25?LTaqDNA聚合酶5?L标记一个微量离心管，用取样器取20?L的预混液加入到该管中。当前15页，总共31页。反应试剂用量PCRSuperMix10μL引物Ⅰ（浓度10μM）1μL引物Ⅱ（浓度10μM）1μL模板DNA5μLddH2O3μL总体积20μL当前16页，总共31页。微量可调移液器（一档吸、二档排）当前17页，总共31页。PCR反应参数：变性94℃30s退火52℃30s延伸72℃60s预变性94℃300s保温72℃600s循环次数35当前18页，总共31页。1、基本概念以琼脂糖凝胶作为介质,DNA在外加电场的作用下泳动的技术。2、实验原理琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，可以形成具有刚性的滤孔，凝胶孔径的大小决定于琼脂糖的浓度。琼脂糖凝胶电泳当前19页，总共31页。琼脂糖凝胶电泳基本原理当前20页，总共31页。当前21页，总共31页。制胶使用电泳缓冲液在制胶器上配制1.0%的琼脂糖凝胶。混样2μL载样缓冲液、2μL核酸荧光染料，10μLPCR产物混匀。点样将上步混好的样10μL加到凝胶孔中。电泳90V电压下电泳10~20min。琼脂糖凝胶电泳的过程当前22页，总共31页。将凝胶倒入制胶器的槽中（60oC）将琼脂糖加入电泳缓冲液,在微波炉中加热溶