第三部分细胞培养与细胞融合.pptVIP

主要内容;第一部分植物细胞分离与培养;1、物理方法

将疏松的愈伤组织放入液体培养基中，经摇床不断振动，使细胞分散。若向细胞悬浮液中吹入脉冲压缩气体，细胞分散的更好。

2、化学方法

是在细胞悬浮培养中加入草酸盐（能结合细胞间质中果胶钙的钙离子）、秋水仙素（0.1mmol/L）或2,4-D或水解乳蛋白（对细胞分散有一定的作用）。

3、酶法

利用果胶酶和纤维素酶使细胞分离。;单细胞培养：

平板培养、看护培养、液体浅层培养、微室培养（微滴培养）等

据培养基形态：

分为固体培养与液体培养（悬浮培养）

细胞固定化培养：;此法适用于难于培养的植物种类;?优点：可以连续观察细胞的分化和发育；

?缺点：通气性差，水分难保持，pH易变动。;一）、悬浮培养(suspensionculture)

定义：是指将单个游离细胞或小细胞团在液体培养基中进行培养增殖的技术。;一是增加培养细胞与培养液的接触面，改善营养供应；

二是在振荡条件下可避免细胞代谢产生的有害物质在局部积累而对细胞自身产生毒害；

三是振荡培养可以适当改善气体的交换；;?悬浮培养物分散性良好，细胞团较小；

?均一性好，细胞形状和细胞团大小大致相同；

?细胞生长迅速（2～3天加倍）。;3、悬浮细胞培养方法;起始愈伤组织的质量；

接种细胞密度；

培养条件：方式、温度；

继代周期。;定义：即把细胞固定在一种惰性基质上，细胞不能运动而培养液可在细胞间流动以供应营养。

按照其支持物不同可以分为两大类：

?A、包埋式固定化培养系统：琼脂、琼脂糖、藻酸盐、聚丙烯酰胺；

?B、附着式固定化培养系统：尼龙网、聚氨酯泡沫、中空纤维。;?流化床生物反应器：

细胞包裹在胶粒、泡沫颗粒中，通入空气使固定化细胞悬浮于反应器中。

?填充床生物反应器：

细胞固定在胶粒、泡沫颗粒或连续的多个网中，细胞固定不动，通过流动的培养液传质。;?膜生物反应器：

－－常见的是中空纤维和螺线式卷绕反应器，传质效率低，易阻塞，产物收获较困难，投资大。;三、植物细胞培养的应用;1、生产药用代???产物

生物碱（吡啶、喹啉、吗啡）、蛋白质类（氨基酸、植物抗生素、胰岛素）、酚类化合物（黄酮类、单酚类、醌类）、萜类化合物（三萜皂甙、甾体皂甙、单萜、倍半萜、二萜）等。;2、生产天然食品、食品添加剂

色素（胡萝卜素、叶黄素、单宁）、甜味剂（甜菊苷）、香料物质、饮料（可可碱、咖啡碱）等；

3、生产杀虫剂、杀菌剂

万寿菊细胞中获得农药噻吩烷；除虫菊的愈伤组织中得到除虫菊脂；香草细胞中分离到鱼藤酮杀虫剂等；

4、生产饲料、精细化工产品;1、两步培养技术（使用两个反应器）;2、固定化培养技术;;(1)诱导剂：

?可引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质,

如无机离子、真菌提取液、葡聚糖等。

?作用机理:

可以调节代谢进程某些酶的活性,并对某些关键酶在转录水平上进行调节。;作用：消除关键酶的阻碍、阻断内源性中

间体的分隔和有效贮存，大大提高次

生代谢物的产量。;第二部分

动物细胞分离与培养;原代培养（primaryculture):将组织取出来后，先用胰蛋白酶等使组织分散成单个细胞，然后配制成一定浓度的细胞悬浮液，再将该悬浮液放入培养瓶中，在培养箱中培养，这个过程称为原代培养。;鸡胚原代细胞：;传（继）代培养（secondaryculture,passage,split):细胞在培养瓶中贴壁生长。随着细胞的生长和增殖，培养瓶中的细胞越来越多，需要定期地用胰蛋白酶使细胞从瓶壁上脱离下来，配制成细胞悬浮液，分装到两个或两个以上的培养瓶中培养，这称为传代培养。

;在离体条件下，细胞一般表现为三种形态：

（1）贴壁依赖型（anchorage-dependent)细胞；

（2）非贴壁依赖型（anchorage-independent)细胞：也称为悬浮型细胞，包括来源于血液的细胞和许多肿瘤细胞。

（3）兼性贴壁细胞：主要是一些细胞系，如CHO细胞。;一、动物细胞体外培养的方法;类似于微生物发酵培养，但对机械剪切力敏感，常采用转瓶和摇瓶培养方式。

缺点：培养细胞密度低且易发生变异;2、贴壁培养;细胞贴壁的过程：;贴壁培养正常细胞在生长过程中随着细胞数量不断增多，生长空间日趋减少，细胞相互接触汇合成片，呈现接触抑制现象（Contactinhibition），而恶性细胞则无接触抑制现象，因此接触抑制可作为区分正常与癌细胞标志之一。

癌细胞则由于营养成分的消耗和细胞代谢产