经典免疫学试验沉淀反应2讲课文档.pptVIP

2.操作步骤(1)用稀释缓冲液将待检样品和标准品按规定稀释，取一定量加至测定管中。(2)加最适工作浓度(用方阵法预先滴定)的抗体，孵育一定时间，测定吸光度(A)值。(3)以不同浓度抗原含量为横轴，吸光度为纵轴，绘标准曲线。从标准曲线可得待检抗原量。第18页，共40页。3.方法评价敏感度高于单相琼脂扩散试验5~10倍，批内、批间重复性较好，变异系数10%，操作简便快速，1h可报告结果。第19页，共40页。(二)散射比浊法散射光系指一定波长的光沿水平轴照射，碰到小颗粒的免疫复合物，光线被折射，发生偏转，这种偏转的角度可因光线波长和颗粒大小不同而有所区别。散射浊度法是在入射光的一定角度检测粒子发出的散射光，散射光的强度与复合物的含量呈正比，即待测抗原越多，形成复合物越多，散射光强度越强。又可分为速率散射比浊法和终点散射比浊法。第20页，共40页。1.速率散射比浊法(1)原理：是一种抗原抗体结合动态测定法。所谓速率是抗原抗体结合反应过程中，在单位时间内两者结合的速度。速率法是测定最大反应速率，即在抗原抗体反应达最高峰时，通常为数十秒钟，测定其复合物形成的量。峰值的高低在抗体过量情况下与抗原的量成正比。峰值出现的时间与抗体的浓度及其亲和力直接相关。不同抗原含量其速率峰值不同，通过微电脑处理，求出抗原含量。第21页，共40页。(2)操作步骤：1)用稀释液将待检抗原稀释成一定浓度。2)将稀释待检抗原和不同浓度抗原标准品加至试管内，再加入一定量抗体，立即比浊，记录速率单位(RU)。3)以抗原标准品含量为横坐标，RU值为纵坐标，于普通坐标纸上绘制标准曲线。根据待测抗原RU值，查出相应抗原含量。第22页，共40页。(3)方法评价：检测不必等到抗原抗体反应达到平衡，大大节约反应时间，每小时可检测数十份标本，敏感度高，最小检出量达μg/L水平。第23页，共40页。2.终点散射比浊法(1)原理：让抗原抗体作用一定时间，使其反应达到平衡后，测定其复合物的量。复合物的浊度不再受时间的影响，但反应复合物聚合产生絮状沉淀之前(大约反应数十分钟)进行浊度测定。第24页，共40页。(2)操作步骤1)用稀释液稀释待检抗原和抗原标准品。2)取一定量稀释待检抗原液和不同浓度抗原标准品溶液加至试管中，加抗体充分混匀，孵育一定时间，比浊。3)以抗原标准品量为横坐标，浊度值为纵坐标，绘制标准曲线。根据待检抗原的浊度值，查出抗原含量。第25页，共40页。(3)方法评价：敏感度达mg/L水平，可自动化，但反应时间较长第26页，共40页。(三)免疫胶乳比浊法1.原理选择一种大小适中，均匀一致的胶乳颗粒，吸附抗体后，当遇到相应抗原时，则发生凝集，单个胶乳颗粒在入射光波长之内，光线可透过，当两个胶乳凝集时，则使透过光减少。这种减少的程度与胶乳凝集成正比，与抗原量成正比。第27页，共40页。2.操作步骤1)用稀释液将待测抗原和抗原标准品稀释。2)将抗体致敏胶乳溶液和待测抗原、不同浓度的抗原标准品反应一段时间，测吸光度值。3)以抗原标准品量为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制标准曲线，查出待测抗原量。第28页，共40页。人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社人民卫生出版社第1页，共40页。（优选）经典免疫学试验沉淀反应第2页，共40页。可溶性抗原+相应抗体肉眼可见的沉淀第3页，共40页。返回总目录目录1897年Kraus就发现细菌培养液（毒素）与相应抗血清混合出现沉淀1905年Bechhold把抗体放在明胶中，将抗原加于其中，发现沉淀反应可在凝胶中进行1946年Oudin报告了试管免疫扩散技术1965年Mancini提出单向免疫扩散技术，使定性免疫试验向定量化发展免疫浊度法的出现，使沉淀反应达到快速、微量、自动化的新阶段。第4页，共40页。根据沉淀反应的介质和检测方法的不同,沉淀反应可分为:液相内的沉淀反应凝胶内的沉淀反应第5页，共40页。第一节液体内沉淀试验根据沉淀现象的不同，液体内沉淀又可分为三类：絮状沉淀环状沉淀免疫浊度沉淀第6页，共40页。一、絮状沉淀试验絮状沉淀试验是一项经典实验技术。曾用于测定梅毒抗体的Kahn试验是絮状沉淀的代表试验，现今已被更简便而敏感的USR或RPR方法替代。第7页，共40页。(一)原理