实验一特殊显微镜的使用2讲课文档.pptVIP

实验一特殊显微镜的使用;优选实验一特殊显微镜的使用;第三页，共32页。;主要内容;1暗视野显微镜;1.1原理

丁达尔现象：在日常生活中，室内飞扬的微粒灰尘是不易被看见的，但在暗的房间中若有一束光线从门缝斜射进来，灰尘便粒粒可见了，这就是微粒发光。

暗视野显微镜就是利用微粒发光原理设计的。

1.2结构特点

使用中央遮光板或暗视野聚光器（常用的是抛物面聚光器），使光源的中央光束被阻挡。不能由下而上地通过标本进入物镜。从而使光线改变途径，倾斜地照射在观察的标本上，标本遇光发生反射或散射，散射的光线投入物镜内，因而整个视野是黑暗的。;暗场显微镜原理;第八页，共32页。;1.3成像特点及优缺点

在暗视野中所观察到的是被检物体的衍射光图像，并非物体本身，所以只能看到物体的存在和运动，不能辨清物体的细微结构。但被检物体为非均质时，并大于1／2波长，则各级衍射光线同时进入物镜，在某种程度上可观察物体的构造。

一般暗视野显微镜虽看不清物体的细微结构，但却可分辨0.004um以上的微粒的存在和运动，这是普通显微镜(最大的分辨力为0.2um)所不具有的特性，可用以观察活细胞的结构和细胞内微粒的运动等。

;1.4应用：微小粒子、细菌形态、细菌记数，透明标本观察等。

1.5暗场显微镜的要求

要求载玻片和盖玻片必须无疵痕和灰尘

物镜前透镜必须清洁无尘

载玻片和盖玻片厚度必须绝对符合要求

;1.6暗场观察方式调节

(1)换上暗场聚光镜（干燥系或油浸系）并在聚光镜透镜上表面滴上镜头油。向上缓慢调升聚光镜，使镜头油与载玻片底面相接触后。

(2)将视场光阑适当缩小，用10X物镜找到被检物体，同时在视场中看到视场光圈的轮廓象。上下缓慢调整聚光镜，使视场光圈像清晰可见。

(3)视场光圈如不在视野中央，可利用聚光镜外侧两个调节螺丝进行调整，再将其开大到相应位置。

;二、荧光显微镜;什么是荧光：物质中的电子吸收光的能量由低能状态转变为高能状态，再回到低能状态时释放出的光，是非温度辐射光——冷光。即：物质吸收短波光，发射出的长波光。

显微镜荧光利用光源激发——光化荧光;荧光的种类：

自发荧光（固有荧光）

二次荧光

;荧光的性质：

吸收光，必需有激发光源

荧光波长＞激发波长（损失热能）

荧光强度极小于激发光的强度

有不同程度的衰减

荧光强度取决于激发光强度、被检物浓度、荧光效率

;二、荧光显微镜的种类：

透射式

落射式

;第十七页，共32页。;第十八页，共32页。;三、荧光显微镜主要部件;荧光显微镜内部构造;落射荧光显微镜光路图;透射荧光显微镜光路图;WU;荧光光源一般采用超高压汞灯(50一200W)，它可发出各种波长的光，但每种荧光物质都有一个产生最强荧光的激发光波长，所以需加用激发滤片（一般有紫外、紫色、蓝色和绿色激发滤片），仅使一定波长的激发光透过照射到标本上，而将其他光都吸收掉。

每种物质被激发光照射后，在极短时间内发射出较照射波长更长的可见荧光。荧光具有专一性，一般都比激发光弱，为能观察到专一的荧光，在物镜后面需加阻断滤光片。它的作用有二：一是吸收和阻挡激发光进入目镜、以免干扰荧光和损伤眼睛。二是选择并让特异的荧光透过，表现出专一的荧光色彩。两种滤光片必须选择配合使用。;四、使用方法．

1．打开灯源，超高压汞灯要预热几分钟才能达到最亮点。

2．透射式荧光显微镜需在灯源与聚光器之间装上所要求的激发滤片，在物镜的后面装上相应的阻断滤片。

落射式荧光显微镜需在光路的插槽中插入所要求的激发滤片／双色束分离器／阻断滤片的插块。

3．放置标本片，调焦后即可观察。使用中应注意：末装滤光片不要用眼直接观察，以免引起眼的损伤；

;4．高压汞灯关闭后不能立即重新打开，需经5分钟后才能再启动，否则会不稳定，影响汞灯寿命。

;五、用途

1观察标本中的自发荧光物质或以荧光素染色或标记的细胞和结构

2标本中的荧光物质在紫外线激发下产生各种颜色的荧光，借以研究该荧光物质在细胞和组织内的分布。组织中的自发性荧光物质如神经细胞和心肌细胞等内的脂褐素呈棕黄色荧光，肝贮脂细胞和视网膜色素上皮细胞内的维生素A呈绿色荧光，某些神经内分泌细胞和神经纤维内的单胺类物质（儿茶酚胺、5－羟色胺、组胺等）在甲醛作用下呈不同颜色的荧光，组织内含有的奎宁、四环素等药物也呈现一定的荧光。;3细胞内的某些成分可与荧光素结合而显荧光，如溴化乙锭与吖啶橙可与DNA综合，进行细胞内DNA含量测定。

4荧光显微镜更广泛用于免疫细胞化学研究，即以异硫氰酸或罗丹明等荧光素标记抗体（一抗或二抗），用该标记抗体直接或间接地与细胞内的相应抗原结