酶蛋白的结构.pptVIP

第29页，共50页，星期日，2025年，2月5日第30页，共50页，星期日，2025年，2月5日8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸顺序至此，已经得出了多肽链被断裂成的各个肽段的氨基酸顺序，但由于没有这些肽段在多肽链中次序的信息，还是无法排出整个多肽链的氨基酸顺序。为此，必须用两种或者两种以上的方法来断裂多肽链，比如用两种蛋白酶分别水解多肽链，将得到两套断裂位点不同的肽段，分别确定这两套肽段的氨基酸顺序，然后利用这两套肽段的氨基酸顺序彼此之间有交错重叠，可以确定整条多肽链的氨基酸顺序。第31页，共50页，星期日，2025年，2月5日通过末端分析得到：N-末端残基为I，C-末端残基为L用胰蛋白酶水解得到第一套肽段，测定出氨基酸顺序分别为：MTYAGKISREALCAFRDALK用胰凝乳蛋白酶水解得到第二套肽段，测定出氨基酸顺序分别为：TYREALAGKDALISRMKCAF第32页，共50页，星期日，2025年，2月5日由于N-末端残基为I，ISR和ISRM是N-末端肽段；又由于C-末端残基为L，EAL和REAL是C-末端肽段。利用两套肽段的氨基酸顺序彼此之间的重叠关系，得出：第一套肽段：N-末端ISRMTYAGKDALKCAFREALC-末端第二套肽段：N-末端ISRMTYAGKDALKCAFREALC-末端推出完整肽链顺序：ISRMTYAGKDALKCAFREAL在上例中，两套肽段之间正好能够相互跨过切口而重叠，从而能确定出肽段在多肽链中的位置，拼凑出整条肽链的氨基酸顺序。第33页，共50页，星期日，2025年，2月5日9.多肽链中二硫键位置的确定对于含有二硫键的蛋白质，我们在分析多肽链氨基酸顺序前先将其拆开，然而在测定完多肽链氨基酸顺序后需要确定链内和链间二硫键的位置，常用的方法是对角线电泳法。不拆开二硫键直接用蛋白酶水解蛋白质，所得肽段样品点样到滤纸中央的电泳原点，在第一个方向上进行电泳，则不同的肽段按其所带电荷和分子大小分离。结束后将滤纸在过甲酸蒸气中熏，二硫键被氧化和拆开。将滤纸旋转90°，在相同条件下进行第二个方向上的电泳。这时，对于不含二硫键的肽段，由于没有发生变化，电泳迁移率不变，电泳后位置应处于对角线上；而含有二硫键的肽段，其大小和电荷发生了变化，电泳迁移率也要改变，电泳后位置偏离对角线，将这些肽段提取出来，进行氨基酸顺序分析，与已经测定的多肽链氨基酸顺序相比较，即可推断出二硫键的位置。第34页，共50页，星期日，2025年，2月5日第35页，共50页，星期日，2025年，2月5日第1页，共50页，星期日，2025年，2月5日第2页，共50页，星期日，2025年，2月5日第3页，共50页，星期日，2025年，2月5日第4页，共50页，星期日，2025年，2月5日蛋白质结构和功能的关系举例：镰刀状细胞贫血病镰刀状细胞贫血病是最早被认识的一种分子病，流行于非洲的一些地区，患者的红细胞形态异常，有很多呈新月状或镰刀状，在红细胞脱氧时镰刀状细胞数量增加，严重时导致红细胞破裂、溶血而致命。镰刀状红细胞产生的原因是患者的血红蛋白异常。血红蛋白是红细胞内起携带氧气功能的一种重要的蛋白质，是一种四聚体蛋白质，由两个α亚基和两个β亚基组成（α2β2），其中α亚基包含141个氨基酸残基，β亚基包含146个氨基酸残基。镰刀状细胞贫血病患者由于基因突变，其血红蛋白（HbS）的β亚基N-末端第6号位的氨基酸由原来正常血红蛋白（HbA）的高度极性的Glu变成了非极性的Val第5页，共50页，星期日，2025年，2月5日这种改变导致血红蛋白表面电荷减少，在脱氧状态下溶解度下降，发生不正常聚集，形成镰刀状红细胞，严重时造成红细胞破裂。血红蛋白分子共有574个氨基酸残基组成，仅仅两个β亚基上各改变了一个氨基酸残基，生理功能就发生了如此大的变化，可见蛋白质的一级结构对功能的影响之大。第6页，共50页，星期日，2025年，2月5日牛胰核糖核酸酶复性实验8个Cys－SH形成4个二硫键的组合方式有7×5×3=105种，因而重新形成正确配对的概率仅1/105，第7页，共50页，星期日，2025年，2月5日第一节蛋白质一级结构研究方法1.蛋白质的分离纯化和相对分子质量的测定2.确定蛋白质分子中多肽链的数目3.拆分并分离蛋白质分子的多肽链4.测定每条多肽链的氨基酸组成5.多肽链的N-末端和C-末端分析6.多肽链的局部断裂和肽段的分离7.测定各个肽段的氨基酸顺序8.确定肽段在多肽链中的次序从而排列出多肽链的氨基酸