大肠杆菌表达系统.pptxVIP

大肠杆菌表达系统简介大肠杆菌是最广泛使用的重要表达系统之一,其简单的细胞结构和快速生长特性使其成为基因工程的首选宿主。这种表达系统可用于大规模生产各种重组蛋白质,如酶、抗体和疫苗等。SN作者：侃侃

大肠杆菌表达系统的优势高表达水平大肠杆菌表达系统能够高效合成大量异源蛋白,表达水平可达到总细胞蛋白的30%甚至更高。简单操作大肠杆菌表达系统利用简单的培养基和诱导系统,操作过程便捷,适合大规模生产。快速生长大肠杆菌生长周期短,只需10-15小时即可完成一个生长周期,大大缩短了蛋白质生产时间。

大肠杆菌表达系统的历史发展1早期发展大肠杆菌表达系统的研究始于20世纪50年代,当时科学家们开始利用这种细菌作为生物制药的载体。2基因工程技术的进步20世纪70年代,DNA重组技术的突破推动了大肠杆菌表达系统的快速发展,使其成为重要的蛋白质生产平台。3技术的不断优化随着分子生物学和基因工程技术的不断进步,大肠杆菌表达系统逐渐成为最常用的细菌表达系统之一。

大肠杆菌表达系统的基本原理大肠杆菌表达系统是利用大肠杆菌作为宿主细胞,将目标基因整合到大肠杆菌染色体或质粒中,借助大肠杆菌强大的代谢能力和快速增殖特性表达所需的蛋白质。其基本原理是将目标基因与启动子、核心RNA聚合酶结合及调控序列等构建成重组质粒,转化到大肠杆菌细胞中,诱导表达产生所需蛋白质。

大肠杆菌表达系统的主要组成部分基因载体表达系统需要一个可以容纳目标基因的质粒或病毒载体。载体包含起始子、选择标记等关键元件。表达宿主大肠杆菌是最常用的宿主菌株,具有快速生长、易操作等优势。适当选择大肠杆菌菌株可以提高表达效率。培养条件表达过程需要合适的培养基、温度、pH值等条件,确保大肠杆菌快速生长并高效表达目标蛋白质。

大肠杆菌表达载体的设计目标基因整合大肠杆菌表达载体必须能够携带和整合目标基因DNA序列,以实现高效的蛋白质表达。载体要具有适当的多克隆位点和限制性酶切位点。调控元件设计载体需要包含强大的启动子和其他调控元件,以控制目标基因的转录和表达。这些可能包括诱导启动子、操纵子和调节基因片段。表达标签融合为了便于目标蛋白的鉴定和纯化,载体可以设计融合标签,如His-Tag、GST或MBP标签。这些标签能够与蛋白质结合,方便后续的分离和纯化。拷贝数控制选择合适的复制起源和抗性标记基因,可以调控载体的拷贝数,从而调节目标基因的表达水平。高拷贝数有利于高产量,但可能会增加代谢负担。

大肠杆菌表达载体的种类质粒载体最常用的大肠杆菌表达载体,可以灵活设计不同大小、复制数和抗性基因。适用于各种目的基因的高效表达。噬菌体载体可以实现外源基因整合到大肠杆菌染色体中,稳定性高。但表达量通常较低,需要专业设备和操作。人工染色体载体可容纳较大的外源DNA序列,适用于复杂基因的表达。但构建和维持较为复杂,表达量也较低。融合蛋白载体将目的蛋白与标签蛋白如6xHis标签融合表达,便于后续纯化和活性检测。但可能影响目的蛋白的天然结构和功能。

大肠杆菌表达载体的选择1操作载体选择易于操作和维护的表达载体,如pET、pBAD系列载体,可简化实验流程。2目的基因兼容性根据目的基因特点,选择与之相匹配的启动子和表达标签,提高表达水平。3宿主菌兼容性选择和宿主菌株相容的表达载体,确保目的蛋白正确折叠和分泌。4可靠性与稳定性选择经过广泛验证、稳定性好的表达载体,确保实验结果的可重复性。

大肠杆菌表达系统的宿主菌株1E.coliK12这是最常用的大肠杆菌表达宿主菌株之一,具有安全性高、生长快、易于遗传操作等优点。2E.coliBL21(DE3)这株菌株广泛应用于重组蛋白的表达,由于缺乏两种蛋白酶而更适合于表达蛋白质。3E.coliOrigami这是一种经过基因工程修饰的菌株,可以帮助重组蛋白质形成正确的二硫键。4E.coliRosetta这株菌株针对大肠杆菌中罕见的密码子进行了优化,可以提高异源蛋白的表达量。

大肠杆菌表达系统的培养条件1培养基选择合适的营养丰富的培养基,如LB培养基、M9最小培养基等。2温度通常在30-37°C下培养,最佳温度为37°C。3pH值维持培养基pH值在6.5-7.5之间,确保细菌生长良好。4溶氧通过摇床或发酵罐充氧,确保细菌有充足的溶解氧吸收。5诱导根据表达载体类型,采用合适的诱导物如IPTG、乙醇等。大肠杆菌表达系统的培养条件是确保蛋白质高效表达的关键。适当的培养基、温度、pH、溶氧以及诱导方式,有利于细菌生长并高效表达目标蛋白。这些参数需要根据具体表达系统进行优化,以获得最高产量和活性。

大肠杆菌表达系统的诱导方式化学诱导通过向培养基中添加特定的化学诱导剂(如IPTG、乙醇等),可以激活大肠杆菌基因表达机制,诱导目标蛋白的高效合成。这种方法简单易行,但需要谨慎选择最佳诱导浓度。温度诱导将培养