第二章 基因突变及其机制.pptVIP

通过对鸟嘌呤N7位点的烷化而导致突变有三种可能：烷化嘌呤引起碱基配对错误，脱嘌呤作用，鸟嘌呤的交联作用第94页，共142页，星期日，2025年，2月5日烷化剂的诱变机制比较复杂，有的尚未完全弄清，但是碱基转换引起错误配对，是造成基因突变的主要原因。烷化剂的诱变效应也很复杂，它们能够诱发DNA多种突变，且形成各种突变类型。其中某些诱变剂诱变效应很高，称为超级诱变剂，如亚硝基胍等。第95页，共142页，星期日，2025年，2月5日烷化剂的性质比较活泼，不太稳定，在水溶液中容易发生水解。因此，化学诱变剂要现用现配。不少烷化剂见光后，容易发生光化学反应，和水解作用一样，有的分解产物会失去诱变作用或具有毒性。因此，保藏时要注意避光，置棕色瓶中，放在干燥器或冰箱中保存。另外，配制烷化剂溶液时，要采用合适的pH缓冲液。第96页，共142页，星期日，2025年，2月5日第97页，共142页，星期日，2025年，2月5日第98页，共142页，星期日，2025年，2月5日一般烷化剂杀菌率低而诱变效应高，如亚硝基类、磺酸酯类等。但烷化剂多数极毒，能致癌，所以无论在配制药品、诱变操作及诱变后器皿处理时，都要小心谨慎，注意安全，避免直接接触身体以及防止污染环境。下面介绍几种常用的烷化剂：第99页，共142页，星期日，2025年，2月5日2、1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(简称亚硝胍，NTG，NG或NG或MNNG)第100页，共142页，星期日，2025年，2月5日亚硝基胍为黄色结晶状物质，性质不稳定，遇光易分解，放出NO，颜色由黄色变为绿色，诱变效应降低。须保存在棕色瓶中，并在避光、干燥、低温条件下贮存。NTG不溶于水，须加助溶剂，使用时现配现用。NTG有超诱变剂之称，能使细胞发生一次或多次突变，诱变效果好，尤其适合于诱发营养缺陷型突变株。其中处理细菌、放线菌等微生物时，不经淘汰，就可以直接得到10%以上的营养缺陷型突变株，而用一般诱变剂处理只能达百分之几至千分之几。NTG还能使多基因并发突变，在复制叉附近一个基因突变能诱发邻近位置的基因陆续连锁突变。第101页，共142页，星期日，2025年，2月5日NTG在水溶液中随着不同的pH将产生不同的分解产物，从而影响诱变效应。当溶液pH低于5.5时，NTG分解成HNO2，HNO2自身就具诱变作用；当溶液pH在8.0以上时，NTG会分解产生重氮甲烷(CH2N2)，对核酸起烷化作用，引起微生物突变；当溶液pH为6.0时，NTG本身和DNA起烷化反应而导致突变。通常在pH6.0的条件下进行诱变处理。由于酸碱条件影响NTG的诱变效果，因此，无论是配制NTG溶液，还是制备菌悬液都要用适宜的缓冲溶液。常用的有磷酸缓冲液和Tris缓冲液。第102页，共142页，星期日，2025年，2月5日NTG的诱变处理方法：①取新鲜的斜面，用一定pH值的磷酸缓冲液或Tris缓冲液洗下细菌作成菌悬液。如果采用细菌细胞或丝状菌孢子(真菌或放线菌)须进行前培养，可用有关培养基代替以上缓冲液，孢子培养时间控制在大部分孢子处在萌动阶段，经离心、洗涤，则可用缓冲液制成悬液，浓度约在106-107/mL；②配制NTG母液：由于NTG不溶于水，配制需加助溶剂甲酚胺或丙酮少许，然后加缓冲溶液，其比例为9：1(缓冲溶液9mL：NTG丙酮溶液1mL)，一般NTG母液浓度配成lmg/mL。使用时取母液0.2mL，加菌悬液1.8mL，NTG最后处理浓度为100ug/mL。一般处理浓度随菌种不同而异，通常细菌为100-1000ug/mL，而放线菌、真菌孢子为1000-3000ug/mL。第103页，共142页，星期日，2025年，2月5日③混合保温，将以上菌悬液和NTG溶液盛于一试管内，置该菌生长适宜的温度下保温(细菌30-35℃、真菌25-28℃、放线菌30-32℃)处理若干时间，一般细菌为20-60min，孢子90-120min。④终止反应：用冷的生理盐水稀释到50倍以上或在低温下进行离心洗涤，除去药液，加无菌水使沉淀悬浮并作成一定稀释度，分离于平皿。如果是细菌，把后培养基按一定浓度加入到菌体沉淀物中振荡培养1.5-2h，经2-3次细胞分裂，把表型稳定的突变细胞培养液进行稀释分离到平皿上。处理完毕后，马上把接触过NTG的器皿用NaOH或Na2S2O3浸泡处理。NTG除以上直接以溶液处理外，还可以按以下方法诱变处理。第104页，共142页，星期日，2025年，2月5日摇瓶振荡处理：在接菌后的培养基中加入5-10ug/mLNTG，并加几滴吐温80或吐温60，使成乳化状(注意吐温对该菌生长是否有影响)；在平皿上生长过程处理：如果将NTG、琼脂和菌体混