基因工程的基本技术序列分析完整PPT.pptVIP

基因工程的基本技术序列分析;第三节DNA序列分析;;;1.Sanger双脱氧链终止法原理;;2具体操作：;假如有一个DNA,互补序列是GATCCGAT,我们试着做一下:;;3、技术路线：;4.双脱氧终止法测序反应体系：;Sanger法DNA测序的试剂;(4)放射自显影得到直读图象

因为ddNTP3’不是-OH，不能与下一个核苷酸聚合延伸，从而终止DNA链的增长。

高负荷，1块胶可测16个样品；

（8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出

三全自动激光荧光DNA测序

↓

(1)用放射性核素标记待测DNA一侧末端

C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换

（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。

（2’,3’-dideoxynucleosidetriphosphate,ddNTP）

ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可以区分长度只差一个核苷酸的DNA分子；;（4）使标记片段变性为单链

将单链模板与一小段引物退火

C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换

4种dNTP(dATP,dGTP,dCTP和dTTP)

Sanger双脱氧链终止法

(chain-terminatormethod)

Noticethedifferentlengthsoflabeledstrandsproducedinthisreaction.

（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。

(3)电泳ACGT次序高压电泳

四荧光标记的单泳道分离的测序原理

(4)放射自显影得到直读图象

同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.

（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。

Sanger双脱氧链终止法

(chain-terminatormethod)

基因工程的基本技术序列分析

①引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡结构

Sanger双脱氧链终止法

(chain-terminatormethod)

单荧光标记四泳道分离和四荧光标记的单泳道分离。

同样有两种情况,如果是ddATP掺入,则产生的序列是GATCCGA,延伸终止,否则可以继续延伸,产生GATCCGAT.;;;1.化学裂解法测序的原理;在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：

G反应----硫酸二甲酯（DMS）使G的N7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶（也叫六氢吡啶）置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。

G+A反应----甲酸使嘌呤环上N原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。

T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。

C反应----在高NaCl存在时，只有C与肼（联氨）发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换;碱基特异性修饰及裂解;（1）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料

（2）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸

（3）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端

（4）使标记片段变性为单链

（5）分4个反应体系，按上述程序（4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长

（6）电泳

（7）放射自显影

（8）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出;;3.化学法的优点;;四标记单泳道法：

ABI公司（美国应用生物系统公司）发展的四标记单泳道法是用4种不同的荧光标记物标记4个反应的产物，4个反应在一个泳道中电泳分离。每个反应产物用不同颜色的荧光标记进行区分，再用计算机将经过荧光