单克隆抗体和基因工程抗体的制备优质文档.pptVIP

单克隆抗体和基因工程抗体的制备;目的要求;大多数抗原分子具有多个抗原决定簇（表位，epitope）。一个抗原决定簇刺激一个B细胞克隆产生一种特异性抗体，一种抗原刺激机体产生多种抗体称为多克隆抗体（polyclonalantibody,PcAb）如免疫血清。由一个只识别一种抗原表位的B细胞克隆产生的同源抗体称为单克隆抗体(monoclonalantibody,McAb)。;单克隆抗体理化性状高度均一，其抗原结合部位完全相同，生物活性专一，特异性强，纯度高，效价高，易于实验标准化及大量制备，是研究抗体的一重大突破。应用比较广，如试剂诊断盒、治疗肿瘤、器官移植及自身免疫病等。;第一节杂交瘤技术的基本原理;一、B淋巴细胞杂交瘤技术

细胞是经抗原免疫的小鼠脾细胞和小鼠骨髓瘤细胞。B细胞能产生抗体，但不能在体外长期生长，而骨髓瘤细胞不产生抗体但在体外能长期生长，二者融合，各保持其本性，既产生抗体又长期生长。

其原理分为几个步骤;目的是制备抗原特异的McAb，所以融合的细胞必须经抗原免疫的B细胞，通常取脾，另一是在体外长期生长又不产生抗体，所以选肿瘤细胞即多发性骨髓瘤细胞，具备以下特点：

;1.稳定、易培养

2.自身不分泌Ig或CK

3.融合率高

4.是HGPRT缺陷株

;目前常用的BALB/c小鼠B细胞瘤株有P3-X63-Ag8.653C（P3.653）、Sp2/0等。为HAT敏感株，易培养,融合率高，最常选用聚乙二醇(PEG)使细胞膜轻度损伤，细胞容易融合。

;（二）选择培养基的应用;细胞的DNA合成一般有两条途径;氨基蝶呤是叶酸的拮抗剂，当氨基蝶呤存在时，能阻断第一条途径。细胞融合的选择培养基中有三种关键成分，次黄嘌呤(hypoxanthine,H)、氨基蝶呤(aminopoterin,A)、胸腺嘧啶核苷(thymidine,T)，三者取前缀缩写为HAT培养基，其融合细胞所用的瘤细胞是经毒性培养基选择出来的HGPRT阴性细胞株。;所以，前面提到的2）瘤细胞与瘤细胞及5)未融合的瘤细胞不能生长，只有1）脾细胞与瘤细胞才能生长，因为脾细胞为HGPRT阳性，通过补偿途径代替氨基蝶呤阻断的主要途径。

;（三）有限稀释与抗???特异性选择;计数，每个孔只放一个细胞，实际是0至数个，整个过程为克隆化，将阳性细胞株重复一次，尽量使抗体更纯，将阳性细胞进行增殖，部分冻存，部分进行体外培养或动物接种。

;另外还有其他杂交瘤技术，如人-人B淋巴细胞杂交瘤和鼠-人B淋巴细胞杂交瘤，人骨髓瘤细胞系体外建株比较困难，生长不稳定，有的分泌IgE，有的分泌Ig的γ、κ链。B细胞取外周血淋巴细胞、脾细胞、淋巴结细胞、病灶浸润性淋巴细胞。从理论上讲很好，但实际比较困难，在于缺乏好的亲体骨髓瘤细胞株，较难获得抗原特异性B淋巴细胞；人杂交瘤细胞不能在小鼠或其他动物体内生长。

;小鼠骨髓瘤与人的B细胞杂交瘤，该技术优点是易获得小鼠骨髓瘤细胞，融合率较高，但最大的缺点是不同种杂交后不稳定，杂交瘤传代后，很快丧失分泌抗体的染色体。

;二、T细胞杂交瘤;T淋巴细胞杂交瘤分为小鼠及人，由于T细胞功能的多样化，制备出的T细胞杂交瘤也各有其特性，如分泌淋巴因子，特异性杀伤功能，分泌抑制因子，自身反应性等。其基本过程是将激活的T细胞与酶缺陷型T淋巴细胞瘤细胞融合，可表达特异性TCR或其他功能的杂交瘤T细胞，与B细胞相以，但细胞激活和阳性克隆筛选较为杂交，不稳定，简介主要步骤。;1.淋巴瘤细胞系的选择

1）体外无限制快速生长

2）融合率高

3）不分泌淋巴因子和杀伤功能

4）缺乏某一特异性表面抗原或受体

5）HGPRT酶缺陷型;2.特异性T细胞的制备与纯化主要有可溶性抗原诱导激活的T细胞、同种反应性T细胞、人的特异性T细胞。;3.T细胞杂交瘤的筛选

通常在含有HAT选择培养基上，用特异性抗体筛选产生淋巴因子的杂交瘤细胞，用抗CD3-TCR抗体筛选阳性细胞。;三、阳性杂交瘤细胞的克隆化培养;将阳性细胞进行单细胞培养，反复2～3次，确保为一单细胞阳性杂交瘤细胞应及时冻存，以防止细胞染色体丢失，发生变异或污染，冻存于液氮（-196℃）,冻存