单克隆抗体与基因工程抗体的制备优秀课件优品文档.pptVIP

单克隆抗体与基因工程抗体的制备;;抗体种类：

第一代抗体多克隆抗体（polyclonalantibody)

第二代抗体单克隆抗体（monoclonalantibody)

第三代抗体基因工程抗体（geneticengineeringantibody);杂交瘤技术的基本原理;基本概念;⑴连接反应一般在灭菌的0.

⑶轻轻混匀，16℃30min。

5、用凝胶成像系统进行分析。

许多抗原抗体反应要求双价的抗原结合位点，使抗原分子上的两个表位交联或使两个抗原分子连接。

工作台、恒温摇床、电泳仪及电泳槽、凝胶成像系统

CATATG

高度的均一性和可重复性

单克隆抗体与基因工程抗体的制备

T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；

12345

融合细胞含有两个不同的细胞核，称为异核体，产生具有原来两个细胞基因信息的单个核细胞，称为杂交细胞（hybridcell）。

Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)

⑴连接反应一般在灭菌的

表达载体2μL

低温高速离心机、超声波粉碎仪、光学显微镜

三、 单克隆抗体的性质鉴定

目的片段3μL;杂交瘤技术的基本原理;流

程;不产生Ig的重链和轻链

HGPRT-;TK-

与提供淋巴细胞的动物品系相同;

动物：

BALB/c小鼠

7～12周龄

20g～25g体重

;细胞性抗原：

（1~2）×107/只，不加佐剂，2~3周重复一次

可溶性抗原：

首次，完全福氏佐剂+100微克抗原，3~6周100~200微克抗原，融合前3天，加强免疫;细胞融合剂：

PEG:分子量4000的PEG是最常用的细胞融合剂

作用机理：诱导细胞膜上脂类物质结构重排，使细胞膜易打开而有助于细胞融合

作用特点：随机发生的，不同厂商、批号、分子量的PEG，其纯度与毒性有所不同;骨髓瘤细胞与淋巴细胞(1:3-10)

50%PEG1min内加完;

10ml培养液终止反应;SP2/0细胞与脾细胞的比例为1：2～5

1ml50%的PEG（无菌，预温37℃）在1分钟内滴完,静置45秒,时间一到,将事先准备的培养液一滴一滴加入,停止PEG作用

根据细胞数量加入HAT培养基，使之分加到96孔板中时每孔细胞数为（0.5～1.5）×105个。融合后7-14天，换用HT培养液;7～20天出现克隆

HAT筛选

挑克隆;HAT培养基：

H（Hypoxanthine）:次黄嘌呤

A（Aminopterin）：氨基喋呤；叶酸拮抗物，阻断DNA合成主要途径

T(Thymidine)：胸腺嘧啶核苷；“核苷酸前体”，供细胞通??替代途径合成DNA;HAT选择作用：

淋巴细胞：不能生长，5~7天死亡；DNA合成的主要途径被A阻断

骨髓瘤细胞：不能生长，5~7天死亡；HGPRT缺乏，DNA合成的替代途径受阻;杂交瘤细胞：

长期生长繁殖

利用淋巴细胞的HGPRT，将H合成为嘌呤碱并最终与T一起合成DNA

从淋巴细胞获得产生某种抗体的遗传信息

从骨髓瘤细胞获得不断繁殖的能力;有限稀释法

特点：

不需任何特殊设备

克隆出现效率高

实验室常用方法

方法：

细胞悬液通过系列稀释

每个培养孔含0.5～1个细胞;单克隆抗体的制备;一、单克隆抗体的产生;Hydrophobicinteractionchromatography(HIC)

TemplatecDNA?????????????5.

4、染色与脱色电泳结束后，分离玻璃板，取出凝胶进行染色，可将无色的凝胶直接放入考马氏亮蓝中振荡染色约1h，再转入脱色液中脱色。

分离纯化目的产物主要依赖于色谱分离技术。

沉淀反应无有

特异性高低

以每克包含体与50ml包含体溶解液的比例配成混悬液，室温搅拌15小时，然后15℃、15000g离心20分钟留取上清，即得血管抑素抽提液。

CTAGA

细胞融合技术产生的杂交瘤细胞可以保持双方亲代细胞的特性

CATATG

纯化的片段及载体

TCTAGA;盐析沉淀

亲和层析

离子交换层析;Ig类型、亚类测定：双扩法或ELISA法

特异性测定：抗原类似物的交叉反应

效价测定：用腹水或培养液的稀释度表示?

表位测定：几株单抗是否为不同表位特异的,用竞?争抑制法，相加指数法及微机集群分析

亲和性测定：测定亲和常数K

杂交瘤细胞染色体：秋水仙素裂解法，小鼠B细胞染色体40条，SP2/0细胞68条，杂交瘤细胞一般100多条

McAb靶抗原分子量：常用westernblot;四、单克隆抗体的特性;优点：

在体外“永久”地存活并传代

用相对不纯的抗原