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基因工程基本操作技术;第一节离心技术;生物样品悬浮液在高速旋转下，由于巨大的离心力作用，使悬浮的微小颗粒(细胞器、生物大分子的沉淀等)以一定的速度沉降，从而与溶液得以分离。

沉降速度取决于颗粒的质量、大小和密度。

离心技术主要用于各种生物样品的分离和制备。

离心技术在生物科学，特别是在生物化学和分子生物学研究领域，己得到十分广泛的应用，每个生物化学和分子生物学实验室都要配置各种类型的离心机。;一、基本原理;∴RCF=1.119×10-5×(rpm)2r

rpm---revolutionsperminute为每分钟转数,r/min

低速离心时常以转速“rpm”来表示

高速离心时则以“g”表示;;二、离心机的主要构造和类型;1、制备性离心机可分为三类

离心机一般有离心主机，转头和离心管三部分组成。

（1）普通离心机：最大转速6000rpm左右

（2）高速冷冻离心机：最大转速为20000～25000rpm（r/min）

（3）超速离心机：转速可达50000～80000rpm，装有真空系统，这是它与高速离心机的主要区别。;;;2、转头;;(2)水平转子;;

(3)区带转头：

区带转头无离心管，主要由一个转子桶和可旋开的顶盖组成。

(4)垂直转头：

其离心管是垂直放置的。

(5)连续流动转头：

转头与区带转头类似，由转子桶和有入口和出口的转头盖及附属装置组成。

;DNA中含有蛋白、多糖

洗涤时，最好用枪头将洗涤液吸出，勿倾倒

DNA中残留有金属离子

上样量超过3ug，电压超过6V/cm，电泳缓冲液陈旧，均可能导致28S和18S条带分不开。

③减少物理因素对核酸的降解。

液氮长期保存，－70℃短期保存

变性的时间不要过长（5分钟），否则质粒易被打断

针对不同材料，选择适当的裂解预处理方式：

液体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。

(3)区带转头：

(1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。

引物和模板的非特异性退火;;离心操作的注意事项;

装载溶液时，根据待离心液体的性质及体积选用适合的离心管。???体不得装得过多，以防离心时甩出，造成转头不平衡、生锈或被腐蚀。

若要在低于室温的温度下离心时。转头在使用前应放置在冰箱或置于离心机的转头室内预冷。

每个转头各有其最高允许转速和使用累计期限，使用转头时要查阅说明书，不得过速使用。

;;

根据离心原理,按照实际工作的需要，目前已有可设计出各种离心方法综合起来大致可分为：;用差速离心法分离已破碎的细胞各组份;常用的梯度材料：

1.糖类:蔗糖、甘油、聚蔗糖(Ficoll)、右旋糖酐、糖原

2.无机盐类:CsCl(氯化铯)、RbCl(氯化铷)、NaCl、KBr等

3.有机碘化物:三碘苯甲酰匍萄糖胺等

4.硅溶胶:如Percoll。

5.蛋白质:如牛血清白蛋白

6.重水

7.非水溶性有机物:如氟代碳等

;1.测定生物大分子的相对分子重量

沉降速度

沉降平衡

接近沉降平衡

2.生物大分子的纯度估计

3.分析生物大分子中的构象变化

;;第二节核酸的提取、纯化与含量测定;;核酸的分类;一、核酸提取的基本原理;二、核酸提取的原理;1.核酸制备的一般原则;(2)核酸纯化应达到的要求：;2.核酸制备时应注意的事项:;3.核酸制备的一般方法和原理;;;使用扩增级DNaseⅠ处理RNA

提取血液基因组DNA时，要选择有核细胞（白细胞）

另外某些富含内源酶的样品(如脾脏，胸腺等)，很难避免RNA的降解。

2、影响提取的主要因素:

细胞器DNA，首先纯化细胞器。

然后，将这两点间划一条直线，在图中间RCF标尺上的交叉点极为相应的相对离心力数值。

降低温度，改变pH及盐的浓度，都利于对核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制剂更有利，当然，几个条件并用更好。

沉淀或吸附核酸，并去除杂质

用PEG8000代替乙醇沉淀DNA：在500μLDNA液中加入200μl20%PEG8000(含1.

可以先将材料贮存在TRIzol或样品贮存液中，于－70℃或－20℃保存

①应保证核酸一级结构的完整性

合成cDNA第一链合成的引物退火失败

(1)提取物质的结构与性质(与其溶解度有关)如:极性物质易溶于极性溶剂，非极性物质易溶于非极性溶剂，酸性物质易溶于碱性溶剂，碱性物质易溶于酸性溶剂，两性电解质在pI时，溶解度最少。

01mol/LEDTA或柠檬酸钠，DNase基本可以全部失活。

③某些蛋白质变性剂也有抑制