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免疫学规定做法归纳

一、免疫学基本操作规范

（一）样本采集与处理

1.血液样本采集

(1)严格遵循无菌操作原则，使用一次性采血针和真空采血管。

(2)采集量需满足后续检测需求，一般成年人为3-5ml。

(3)避免采血部位有炎症或损伤，采集后立即进行抗凝处理。

2.组织样本处理

(1)快速获取后置于4℃生理盐水中清洗。

(2)根据实验需求选择合适的固定液（如4%多聚甲醛）。

(3)固定时间控制在6-12小时，避免过度固定影响抗原表达。

（二）试剂配制与管理

1.标准试剂配制

(1)所有配制均需使用超纯水或无菌水。

(2)pH值调节需使用专用缓冲液（如Tris-HCl缓冲液）。

(3)配制后需进行0.22μm滤膜除菌处理。

2.试剂保存要求

(1)生物试剂需置于-20℃保存，如酶标抗体。

(2)低温保存的试剂需定期检测活性，一般3个月检测一次。

(3)易降解试剂建议分装保存，单次用量分装后立即冻存。

二、免疫学检测技术规范

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.检测步骤

(1)**板处理**：用封闭液封闭96孔板2小时，37℃避光。

(2)**样本加载**：每孔加入100μl样本或标准品，设空白对照。

(3)**孵育**：加入100μl酶标抗体，37℃孵育1小时。

(4)**洗涤**：用洗涤液洗板5次，每次间隔3分钟。

(5)**显色**：加入TMB底物液，避光反应30分钟。

(6)**终止**：加入2mol/LH?SO?终止反应，混匀后酶标仪检测。

2.质量控制要点

(1)所有试剂需在有效期内使用，避免反复冻融。

(2)严格按照标准曲线进行定量，建议制作5个浓度梯度。

(3)OD值读数范围控制在0.2-2.0之间，超出范围需重新稀释。

（二）流式细胞术操作规范

1.样本前处理

(1)血液样本需用肝素抗凝，避免细胞聚集。

(2)红细胞裂解需在室温下进行，时间控制在10分钟内。

(3)处理后的细胞需用PBS缓冲液重悬，避免沉淀。

2.染色操作

(1)单克隆抗体需预先用冷PBS稀释，浓度≤1μg/μl。

(2)染色时间控制在20-30分钟，冰上避光进行。

(3)活细胞染料（如PI）需最后加入，防止细胞凋亡。

三、实验室安全与废弃物处理

（一）操作安全规范

1.个人防护要求

(1)操作时必须佩戴实验服、手套，必要时佩戴护目镜。

(2)涉及放射性同位素时需穿戴铅衣。

(3)每次实验后需用75%酒精擦拭操作台面。

2.设备使用规范

(1)高速离心机需在盖好盖板后启动。

(2)生物安全柜需定期进行风速检测，维持在90L/min以上。

(3)液氮罐使用时需保持至少1/3液位，避免干烧。

（二）废弃物分类处理

1.化学废弃物

(1)涂片类废弃物需用10%次氯酸钠浸泡1小时。

(2)废弃培养基需用酸碱中和后排放。

(3)分类存放于防漏桶中，定期交由专业机构处理。

2.生物废弃物

(1)一次性耗材需用双层黄色垃圾袋包裹。

(2)病原体样本需经高压灭菌（121℃15分钟）。

(3)所有废弃物需记录存档，保存期不少于3年。

二、免疫学检测技术规范

（一）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.检测步骤

（1）**板处理**：用封闭液封闭96孔板2小时，37℃避光。

-**具体操作**：将稀释好的5%脱脂奶粉或封闭抗体（如BSA）溶液用移液器均匀加入每个孔中，每孔100-200μl。盖上板盖，置于37℃恒温箱中，避光封闭。封闭时间可根据试剂说明书调整，通常为1-4小时。期间可轻震混匀数次，确保封板液均匀接触板底。

-**质量控制**：封闭后需用洗涤液充分洗涤（见下文洗涤步骤），若板孔仍有颜色或背景较高，则提示封闭不彻底，需延长封闭时间或更换封闭液。

（2）**样本加载**：每孔加入100μl样本或标准品，设空白对照。

-**具体操作**：吸弃孔内封闭液（不拍干），使用不同移液器头吸取样本或标准品，每孔加入100μl。设置空白孔（不加样本，加封闭液代替）、阴性对照（已知阴性样本）、阳性对照（已知阳性样本）和质控孔（重复样本或标准品）。轻轻晃动微板摇床，使样本与板底充分接触，室温静置1小时或4℃过夜。

-**注意事项**：样本浓度过高时需用稀释液进行适当稀释，确保在检测范围内。过夜孵育需防止霉菌滋生，可加盖无菌膜。

（3）**孵育**：加入100μl酶标抗体，37℃孵育1小时。

-**具体操作**：吸弃孔内样本液，用洗涤液洗涤3次。用移液器加入稀释好的酶标抗体（如HRP标记的二抗或生物素标记的一抗），每孔100μl。盖上板盖，置于37℃恒温箱中孵育1小时，期间可每隔15分钟轻震混匀一次。

-**抗体选择**：根据检测目标选择合适种属来源的抗体