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免疫学抗体实验操作流程

一、实验概述

免疫学抗体实验是研究抗体结构、功能及其与抗原相互作用的重要方法，广泛应用于基础研究、疾病诊断和生物制品开发。本流程涵盖抗体制备、纯化、鉴定及应用等关键环节，旨在提供标准化、规范化的操作指导。

二、实验准备

（一）试剂与材料

1.抗体溶液：根据实验需求配置不同浓度（如0.1-1.0mg/mL）

2.抗原溶液：纯化抗原或重组蛋白，浓度需经测定（如10-100μg/mL）

3.缓冲液：磷酸盐缓冲液（PBS）、Tris-HCl等，pH值需精确调节（6.5-8.0）

4.试剂：吐温-20（Tween-20）、甘氨酸、甲醇等纯化辅助剂

5.仪器：离心机、电泳仪、酶标仪、纯水系统等

（二）耗材准备

1.微量离心管（0.22μm滤膜）

2.纯化柱（如蛋白G/蛋白A亲和层析柱）

3.一次性手套、移液器吸头等

三、实验步骤

（一）抗体制备

1.抗原免疫动物：选择BALB/c、C57BL/6等实验动物，按标准免疫程序注射抗原（如佐剂乳化、多点注射）

2.血清采集：免疫后定期采血，通过血清分离机分离血浆

3.抗体纯化：采用亲和层析法

(1)预处理：血清经0.22μm滤膜除菌后，加入蛋白G/A柱（流速1mL/min）

(2)洗脱：用含0.5-1.0MNaCl的缓冲液梯度洗脱（pH7.0-8.0）

(3)收集：通过蛋白检测仪（如280nm吸光度）收集抗体峰段

（二）抗体纯化

1.层析柱预处理：用平衡缓冲液（含0.1%Tween-20）平衡柱子（体积≥5倍柱体积）

2.上样与洗脱：

(1)上样：抗体溶液缓慢通过柱子（流速≤0.5mL/min）

(2)洗脱：先用低盐缓冲液（0.1MNaCl）洗去未结合杂质，再用高盐缓冲液（1.0MNaCl）洗脱目标抗体

3.收集与浓缩：收集抗体组分，通过超滤管（截留分子量3000Da）浓缩至目标浓度

（三）抗体鉴定

1.SDS电泳：

(1)凝胶配置：12%分离胶+4%浓缩胶，加入考马斯亮蓝R-250染色

(2)结果分析：通过凝胶成像仪分析抗体条带纯度（纯度≥90%为合格）

2.WesternBlot验证：

(1)配制抗原膜：转膜后用5%脱脂奶粉封闭（4℃过夜）

(2)一抗孵育：抗体工作浓度0.1-0.5μg/mL，室温孵育1-2h

(3)二抗结合：辣根过氧化物酶标记的二抗（如1:5000稀释），孵育1h

四、结果分析

（一）纯化效果评估

1.纯度检测：通过SDS和WesternBlot验证抗体纯度及特异性

2.活性测定：采用ELISA法检测抗体结合活性（A值≥0.8为合格）

（二）储存条件

1.稳定剂：加入0.01%NaN3（终浓度）和20%甘油保护

2.保存方式：-20℃避光保存，反复冻融≤3次

五、注意事项

1.操作需在洁净台进行，避免污染

2.每步操作后需用75%乙醇消毒工作台面

3.抗体使用前需通过无菌检测（≥99.9%无内毒素）

4.高浓度抗体需分装保存，避免反复冻融损失活性

**一、实验概述**

免疫学抗体实验是研究抗体结构、功能及其与抗原相互作用的重要方法，广泛应用于基础研究、疾病诊断和生物制品开发。本流程涵盖抗体制备、纯化、鉴定及应用等关键环节，旨在提供标准化、规范化的操作指导。通过系统化的实验设计，可以确保获得高纯度、高活性的抗体，为后续的实验研究奠定坚实基础。

**二、实验准备**

（一）试剂与材料

1.抗体溶液：根据实验需求配置不同浓度（如0.1-1.0mg/mL），需使用无菌水或特定缓冲液溶解，并经0.22μm滤膜除菌处理。储存于-20℃或-80℃，避免反复冻融。

2.抗原溶液：纯化抗原或重组蛋白，浓度需经测定（如10-100μg/mL），使用pH7.4的PBS或Tris-HCl缓冲液配制，并经0.22μm滤膜除菌。储存于-20℃。

3.缓冲液：

*磷酸盐缓冲盐溶液（PBS）：pH7.4，含0.01MNaH2PO4和0.137MNaCl，适用于多数免疫实验。

*Tris-HCl缓冲液：pH7.5-8.0，含0.1MTris-HCl和0.01MEDTA，适用于某些酶联免疫吸附实验（ELISA）。

*甘氨酸缓冲液：pH2.8-3.0，用于抗体分子量测定（SDS）。

4.试剂：

*吐温-20（Tween-20）：0.05%-0.1%浓度，用于洗涤步骤，提高非特异性结合蛋白的洗脱效率。

*甘氨酸：用于SDS凝胶电泳的浓缩胶和分离胶配制。

*甲醇：用于WesternBlot膜封闭和抗体稀释。

*无水乙醇：用于SDS凝胶固定和抗体固定。

*DTT或β-巯基乙醇：还原剂，用于S