核酸提取与鉴定.ppt

4、一步快速热酚抽提法将异硫氰酸胍、巯基乙醇和去污剂N-十二烷基肌氨酸钠（SLS）等联合使用，抑制RNA的降解，裂解细胞，增强对核蛋白复合物的解离，使RNA与蛋白质分离；然后用苯酚、氯仿等抽提去除蛋白质和DNA，乙醇或异丙醇沉淀纯化RNA。此法操作简便快速，可在3小时以内处理大批样品，对大量或少量组织的细胞RNA提取均甚合适。第30页，共53页，星期日，2025年，2月5日二、mRNA的提取从提取的总RNA中分离mRNA，用Oligo（dT）-柱层析法分离：mRNA含polyA，在高盐浓度条件下与Oligo（dT）结合，其他成分被洗掉，再通过低盐浓度洗脱mRNA而分离。第31页，共53页，星期日，2025年，2月5日第四节核酸的鉴定一、核酸浓度检测1、定磷法DNA和RNA中都含有磷酸，根据元素分析获知RNA的平均含磷量为9.4%，DNA的平均含磷量为9.9%，因此可从样品中测得的含磷量来计算DNA或RNA的含量。2、定糖法RNA含核糖，DNA含有脱氧核糖，根据这两种糖的颜色反应可对DNA和RNA进行定量测定。第32页，共53页，星期日，2025年，2月5日3、紫外吸收法DNA和RNA在波长260nm处有很高的吸收峰值，用标准样品测得在波长260nm处，A260＝1时，样品中双链DNA浓度为50μg/ml，单链DNA或RNA浓度为40μg/ml。DNA(μg/μl)=A260×50×稀释倍数/1000RNA（μg/μl）=A260×40×稀释倍数/1000第33页，共53页，星期日，2025年，2月5日二、核酸纯度检测核酸的纯度用A260/A280比值表示。OD260/OD280＝1.8——为DNA纯品OD260/OD280＝1.8~2.0——为RNA纯品第34页，共53页，星期日，2025年，2月5日三、核酸完整性检测核酸样本的完整性和分子量可通过琼脂糖凝胶电泳测定（RNA常采用甲醛琼脂糖变性凝胶电泳），溴化乙锭染色，紫外灯观察。凝胶上DNA存在处可观察到清晰的条带。完整性良好的总RNA应该清晰地看到28srRNA、18srRNA、5srRNA的三条带，其中28srRNA的亮度应为18srRNA的两倍，5srRNA较弱。

第35页，共53页，星期日，2025年，2月5日基因组DNA抽提结果电泳图第36页，共53页，星期日，2025年，2月5日总RNA抽提结果电泳图mRNA第37页，共53页，星期日，2025年，2月5日第五节电泳根据电泳支持介质分：琼脂糖凝胶电泳：多用于鉴定较大核酸片段（0.1～60kb），特别是分子量测定聚丙烯酰胺凝胶电泳：用于鉴定较小的核酸片段，特别是DNA测序第38页，共53页，星期日，2025年，2月5日**核酸提取与鉴定第1页，共53页，星期日，2025年，2月5日研究对象：基因组DNA、质粒DNA、总RNA、mRNA等过程：核酸提取裂解：破碎细胞，使细胞中的核酸游离在裂解体系中纯化：使核酸与裂解体系中的其它成分，如蛋白质、盐及其它杂质彻底分离第2页，共53页，星期日，2025年，2月5日核酸提取的主要步骤：破碎细胞提取纯化I.材料准备II.破碎细胞或包膜——内容物释放III.核酸分离、纯化IV.沉淀或吸附核酸，并去除杂质?V.核酸溶解在适量缓冲液或水中第3页，共53页，星期日，2025年，2月5日总原则：①应保证核酸一级结构的完整性；②排除其它分子的污染。鉴定：浓度、纯度、完整性鉴定技术：分光光度技术、凝胶电泳技术第4页，共53页，星期日，2025年，2月5日第一节预处理一、样品预处理1、组织组织有新鲜组织、甲醛固定或石蜡包埋组织。新鲜组织先用生理盐水洗，然后将其捣碎或剪碎，加液氮研磨成粉状，加细胞裂解液裂解细胞；甲醛固定组织要先去掉甲醛；石蜡包埋组织要经过组织切片和二甲苯脱蜡等处理。第5页，共53页，星期日，2025年，2月5日2、培养细胞培养细胞需弃细胞培养液，用缓冲液进行多次漂洗，方可用于提取核酸。第6页，共53页，星期日，2025年，2月5日3、血液血液可以是新鲜血液或者冻贮血液；注意抗凝剂的选择，一般用EDTA-Na2或枸橼酸钠，不可使用肝素；