电子克隆及序列分析.pptVIP

电子克隆及序列分析第1页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是电子克隆拼图游戏一样的原理应用操作过程优点与缺点的讨论现状与展望内容第2页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是电子克隆WatsonCrick成功解析了DNA分子二级结构，开创了分子生物学时代KarryMullis发明了PCR反应，体外大规模、有目的和快速地克隆目标基因成为可能信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展第3页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是电子克隆表达序列标签（expressedsequencetags，EST）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200~600bp由于基因表达调控作用不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个ESTEST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式第4页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是电子克隆电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法第5页，共27页，星期日，2025年，2月5日什么是电子克隆传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼第6页，共27页，星期日，2025年，2月5日拼图游戏一样的原理相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响第7页，共27页，星期日，2025年，2月5日拼图游戏一样的原理借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因第8页，共27页，星期日，2025年，2月5日应用电子克隆主要应用于两个方面：一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因目前应用比较广泛的是第一方面第9页，共27页，星期日，2025年，2月5日应用数据库查询数据库比对文件下载序列分析序列装配分子模型结构分析功能分析第10页，共27页，星期日，2025年，2月5日应用在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下：分析和定位开放阅读框虚拟翻译并对多肽链序列检索比对可靠性检查分析与之相关的调控序列第11页，共27页，星期日，2025年，2月5日如何做拼图游戏基于EST的电子克隆基于Unigene的电子克隆第12页，共27页，星期日，2025年，2月5日（一）基于EST的电子克隆1.确定探针序列(电子克隆的基因)（1）以已知物种的基因序列为探针，这个基因可能在这个物种上没有被测序。（2）已已经测序得到的一段EST为探针。如:以小鼠Alox12mRNA为探针,电子克隆牛的Alox12基因第13页，共27页，星期日，2025年，2月5日2.搜索同源的ESTs,并下载到本地，成为*.SEQ文件格式采用Blast在线根据搜索与探针相似性高（80％）的大量ESTs，/Blast.cgi（一）基于EST的电子克隆第14页，共27页，星期日，2025年，2月5日3.拼接采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。注意：对序列进行末段修剪去掉冗余部分。（一）基于EST的电子克隆第15页，共27页，星期日，2025年，2月5日3.拼接采用DNASTAR6.0的Seqman程序进行。注意：序列剔除，以提高准确性。4.保存contig序列。5.重复：以4中的contig为探针，重复步骤2，3，4。直到不能在延伸为止。（一）基于EST的电子克隆第16页，共27页，星期日