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rAAV8-hFⅧ治疗血友病A：临床前研究的关键进展与挑战

一、引言

1.1研究背景与意义

血友病A作为一种严重的遗传性出血性疾病，给患者及其家庭带来了沉重的负担。由于凝血因子Ⅷ（FⅧ）的缺乏，患者面临着自发性出血或轻微创伤后出血不止的风险，关节出血、肌肉出血等症状不仅严重影响患者的生活质量，长期积累还可能导致关节畸形、功能障碍甚至危及生命。传统的替代治疗方法需要频繁输注外源性FⅧ制剂，这不仅费用高昂，还存在感染传染病、产生抑制物等问题，给患者的治疗带来诸多困扰。

随着基因治疗技术的不断发展，rAAV8-hFⅧ基因治疗为血友病A患者带来了新的希望。这种治疗方式通过将编码人FⅧ的基因导入患者体内，有望实现患者自身持续表达FⅧ，从而达到长期治疗甚至治愈的目的。开展rAAV8-hFⅧ治疗血友病A的临床前研究具有重要的现实意义。它可以深入了解该治疗方法的安全性和有效性，为后续的临床试验和临床应用提供坚实的理论和实验基础，推动血友病A治疗领域的重大突破，改善患者的生活状况，减轻社会医疗负担。

1.2血友病A概述

1.2.1血友病A的发病机制

血友病A是一种X连锁隐性遗传性出血性疾病，其发病根源在于X染色体长臂末端（Xq28）上的FⅧ基因发生缺陷。FⅧ基因包含26个外显子和25个内含子，长度约186kb，基因缺陷类型丰富多样，像点突变、插入、缺失以及倒位等情况都有可能出现。其中，内含子22倒位和内含子1倒位是致使重型血友病A的关键原因，在重型患者里，它们分别大约占据40%-50%和5%-10%。

在正常的凝血过程中，FⅧ扮演着不可或缺的角色，它作为辅因子，与活化的凝血因子Ⅸ（FⅨa）形成复合物，进而激活凝血因子Ⅹ（FⅩ），这一过程能够有效加速凝血酶原向凝血酶的转化，对纤维蛋白凝块的形成起到促进作用。而当FⅧ缺乏时，凝血活酶的生成就会受到阻碍，凝血过程难以顺利进行，患者便会呈现出出血倾向。

1.2.2血友病A的临床表现与分类

血友病A患者的临床表现主要以出血症状为主。关节出血是血友病A最具典型特征的出血表现，常常出现在膝关节、踝关节、肘关节等负重关节。在急性期，患者的关节会出现疼痛、肿胀以及活动受限的症状，局部皮温也会升高。如果关节反复出血，就会致使关节软骨遭到破坏、滑膜增生，最终引发关节畸形和功能障碍，也就是我们所说的血友病性关节病。肌肉出血也是较为常见的情况，多发生于用力的肌群，比如腓肠肌、股四头肌、臀大肌等，症状表现为局部疼痛、肿胀、硬结，还可能伴有血肿形成。要是肌肉出血量较大，就会压迫周围的神经、血管，进而引发神经损伤、缺血性肌挛缩等并发症。除此之外，患者还可能出现鼻出血、牙龈出血、消化道出血、泌尿道出血以及颅内出血等症状。其中，颅内出血是最为严重的出血并发症，虽然其发生率较低，可一旦发生，病死率相当高。

依据患者血浆中FⅧ活性（FⅧ：C）的水平，血友病A可分为轻型（FⅧ：C＞5%-40%）、中型（FⅧ：C1%-5%）和重型（FⅧ：C＜1%）。轻型和中型患者的症状相对来说比较轻微，而重型患者则有着明显的自发出血倾向，致残风险很高。

1.3基因治疗现状与rAAV8载体

1.3.1血友病A基因治疗发展历程

血友病A的基因治疗研究经历了多个重要阶段。早期，科研人员尝试利用非病毒载体进行基因治疗，但由于非病毒载体存在转染效率低、基因表达不稳定等问题，治疗效果并不理想。随后，病毒载体逐渐成为研究的重点，逆转录病毒载体（RV）和慢病毒载体（LV）等被应用于血友病A的基因治疗研究中。然而，RV存在插入突变导致细胞癌变的风险，LV虽然能够整合到宿主基因组中实现长期稳定表达，但也面临着潜在的免疫原性和安全性问题。

随着研究的不断深入，重组腺相关病毒（rAAV）载体因其独特的优势逐渐脱颖而出。在早期的血友病B基因治疗研究中，科研人员通过直接肌肉注射将携带人F9基因的rAAV导入肌细胞，这一策略在小鼠和狗模型中取得了一定的成功，不过在临床试验中，FⅨ的表达却未能达到治疗水平，目前这一策略已基本被淘汰。后来，人们构建了肝细胞特异性增强子/启动子驱动表达的rAAV-F9基因载体，实现了FⅨ在肝细胞中的特异性表达，通过肝动脉、门静脉或静脉注射治愈了血友病B鼠、狗和灵长类动物，为临床试验奠定了坚实的基础。2010年，Nathwani等采用免疫原性较低的rAAV8携带密码子优化的F9基因，在6例没有抑制物产生病史的血友病B患者中进行基因治疗，所有患者FⅨ的表达均达到治疗水平，且持续时间长达3年，这是基因治疗成功治愈血友病的重要案