Marfey法和质谱联用技术讲课文档.pptVIP

Marfey法和质谱联用技术第1页，共55页。

Marfey法和质谱联用技术第2页，共55页。

目录前言LC/MS决定氨基酸绝对构型的原理1.Marfey法分离机制的探讨2.Marfey法与质谱的联用3.衍生化过程小结应用举例第3页，共55页。

前言常见的确定化合物立体结构的方法有如下几种：（1）化学转变法；（2）旋光比较法；（3）旋光谱（ORD）和圆二色光谱（CD）；（4）单晶X－射线衍射法；（5）核磁共振法；（6）Marfey法与质谱联用。第4页，共55页。

目前酶法和CD法已用于决定氨基酸的绝对构型，但这些都是直接的方法，确定一种对映异构体时需要相对大量的样品及较长的分析时间，因为在分析之前必须将每种氨基酸分离出来。另一方面，色谱方法例如GC和HPLC已经代替这些直接方法广泛使用，氨基酸的绝对构型是通过衍生化后，在非对映环境下比较对照品氨基酸的保留时间来决定的，这些色谱学方法的优点在于分析所用的样品用量少、节省时间，并且可以同时分析十种以上氨基酸。色谱学方法的缺点在于需要对照品氨基酸，对于含有非常见氨基酸的肽类是不适用的。第5页，共55页。

1984年，Marfey发明了一种用HPLC来决定氨基酸绝对构型的方法，该方法基于这样一个原理：通过手性试剂进行衍生化，将D-和L-氨基酸用HPLC分离成对映异构体。于是引入手性试剂FDAA（（1-氟-2，4-二硝基苯基-5）-L-丙氨酰胺，(1-Fluoro-2，4-dinitrophenyl-5)-L-alaninamide），被命名为Marfey试剂。第6页，共55页。

氨基酸与Marfey试剂反应所得衍生物用常用的HPLC进行分离，并在UV340nm处进行检测。L-氨基酸衍生物常常先于对应的D-氨基酸衍生物从柱上洗脱下来，在梯度洗脱的条件下，该方法能正确地确定氨基酸的绝对构型，并且具有很高的灵敏度。因此，Marfey法广泛用于肽类化合物的结构确证，证实肽类合成中的外消旋作用。但是，在没有标准品的情况下，将该方法用来分析含非常见氨基酸的肽类还是很困难的。第7页，共55页。

常见的Marfey试剂如下所示：L-FDAA:(1-氟-2，4-二硝基苯基-5)-L-丙氨酰胺L-FDVA:……………..……………..-L-缬氨酰胺L-FDPA:……………..……………..-L-苯丙氨酰胺L-FDIA:……………..……………..-L-异亮氨酰胺L-FDLA:……………..……………..-L-亮氨酰胺D-FDAA:……………..……………..-D-丙氨酰胺第8页，共55页。

其结构如下：第9页，共55页。

为了将Marfey法与质谱联用的方法建立起来，必须解决如下三个问题：（1）解释Marfey法用作色谱技术的分离机制，及其局限。（2）如何在没有标准品的情况下有效地将Marfey法和质谱联系起来，来检测和确定目标氨基酸。（3）如何从一个肽类样品的L-或D- 氨基酸中获得相应的对映异构体第10页，共55页。

LC/MS决定氨基酸

绝对构型的原理Marfey法分离机制的探讨Marfey法与质谱的联用衍生化过程第11页，共55页。

Marfey法分离机制的探讨下图是用LC/MS来决定肽中氨基酸绝对构型的全过程，命名作“高级Marfey法”第12页，共55页。

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本法将可购得的氨基酸分为四类：中性氨基酸、含-OH和酸性氨基酸、碱性和N-甲基氨基酸，在同样的条件下研究其分离行为。FDAA主要与氨基酸上未取代的氨基、酚羟基、巯基包括N-甲基反应。第15页，共55页。

每种氨基酸的非对映异构体对都是通过其D-异构体的保留时间(tRD)和L-异构体的保留时间(tRL)的差值(△t)来判定的。当△t值大于±1.0时，每组非对映异构体对完全被分离为两个非对映异构体。左边的表格显示了四种氨基酸的两种异构体保留时间及其差异。第16页，共55页。

对中性氨基酸已经获得很好的判定，所有L-型非对映异构体都先于D-型被洗脱下来。随着烃基侧链增长，判定效率提高，保留时间也会更长（亚氨基酸和脯氨酸除外）。酪氨酸得到两衍生物，因为FDAA会引入到－NH2上，也会引入到酚－OH上。第17页，共55页。

酸性或含－OH氨基酸的判定相对于中性氨基酸要难一些。因为其保留时间变短。侧链含有酰氨基的天冬酰胺、谷氨酰胺比天冬氨酸和谷氨酸更难判定。在含－OH的氨基酸中，丝氨酸显示出最差的判定能力，但是高丝氨酸的判定稍好些，氧甲基丝氨酸显示了与丙氨酸相似的判定能力。另外，β-OH天冬氨酸的两个非对映异