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免疫学实验技术操作手册

一、概述

免疫学实验技术是现代生物医学研究的重要手段，广泛应用于疾病诊断、疫苗开发、免疫调节机制探索等领域。本手册旨在提供一套系统化、标准化的实验操作指南，帮助研究人员规范操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验准备

（一）实验环境

1.保持实验室洁净，温湿度控制在20–24℃、湿度45–60%范围内。

2.使用无菌操作台进行细胞培养、ELISA等实验，确保无污染。

3.配备生物安全柜、离心机、酶标仪等核心设备，定期校准。

（二）试剂与耗材

1.试剂准备：

(1)免疫试剂（如抗体、抗原）需使用PBS或Tris缓冲液稀释，浓度梯度为0.1–1μg/mL。

(2)细胞培养基（如DMEM/F12）需添加10%–15%胎牛血清（FBS），并高压灭菌。

2.耗材准备：

(1)96孔板、细胞培养皿、微量移液器吸头等需一次性使用。

(2)二抗、酶标抗体需避光保存于–20℃或–80℃冰箱。

三、核心实验技术

（一）细胞免疫荧光检测

1.细胞固定：

(1)用4%多聚甲醛溶液固定细胞30–60分钟。

(2)PBS清洗3次，每次5分钟。

2.封闭操作：

(1)加入5%–10%山羊血清封闭1–2小时。

(2)吸去封闭液，加入一抗（浓度1–5μg/mL）孵育4–6小时或过夜。

3.显色与观察：

(1)加入二抗（如AlexaFluor488标记）孵育1小时。

(2)DAPI复染细胞核，使用荧光显微镜观察（激发波长488nm/561nm）。

（二）酶联免疫吸附实验（ELISA）

1.抗原包被：

(1)将重组抗原（浓度10–50μg/mL）包被96孔板，4℃过夜。

(2)稀释洗涤液（含0.05%Tween-20的PBS），洗板3次。

2.试剂孵育：

(1)加入一抗（浓度0.1–1μg/mL）孵育1–2小时。

(2)加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育1小时。

3.结果检测：

(1)加入TMB显色液，室温避光反应30分钟。

(2)使用酶标仪检测450nm波长吸光度值（标准曲线法计算浓度）。

（三）流式细胞术分析

1.细胞制备：

(1)PBS洗涤细胞，离心收集（1000rpm，5分钟）。

(2)用固定液（如多聚甲醛）固定细胞，4℃保存。

2.染色操作：

(1)用破膜剂透化细胞膜（如Paraformaldehyde/CD3抗体）。

(2)加入荧光标记抗体（如CD4-PE/CD8-FITC），室温避光孵育30分钟。

3.数据采集：

(1)使用流式细胞仪（如FACSCantoII）设置门控，分析细胞亚群比例（如CD4+T细胞占比）。

四、实验数据处理

（一）数据标准化

1.每组实验设置复孔（n≥3），计算平均值±标准差（SD）。

2.ELISA数据使用四参数回归方程拟合标准曲线，校准样本浓度。

（二）统计分析

1.使用GraphPadPrism或SPSS软件进行数据分析。

2.组间比较采用t检验或ANOVA（P0.05为差异显著）。

五、安全注意事项

（一）个人防护

1.操作时佩戴手套、护目镜，穿实验服。

2.细胞裂解液、酶标底物等需佩戴耐化学手套。

（二）废弃物处理

1.液体废弃物需用10%次氯酸钠溶液灭活后排放。

2.耗材分类收集，锐器放入专用锐器盒。

六、附录

（一）常用试剂配方

1.PBS缓冲液：NaCl137mM，KCl2.7mM，Na?HPO?10mM，KH?PO?1.8mM，pH7.4。

2.封闭液：5%山羊血清（ThermoFisher）。

（二）设备维护记录表

|设备名称|校准日期|使用频率|备注|

|||||

|酶标仪|2023-11-01|每周||

|流式细胞仪|2023-10-15|每月||

一、概述

免疫学实验技术是现代生物医学研究的重要手段，广泛应用于疾病诊断、疫苗开发、免疫调节机制探索等领域。本手册旨在提供一套系统化、标准化的实验操作指南，帮助研究人员规范操作流程，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验准备

（一）实验环境

1.保持实验室洁净，温湿度控制在20–24℃、湿度45–60%范围内。

2.使用无菌操作台进行细胞培养、ELISA等实验，确保无污染。

3.配备生物安全柜、离心机、酶标仪等核心设备，定期校准。

（二）试剂与耗材

1.试剂准备：

(1)免疫试剂（如抗体、抗原）需使用PBS或Tris缓冲液稀释，浓度梯度为0.1–1μg/mL。

(2)细