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免疫学实验流程操作规范

一、免疫学实验流程操作规范概述

免疫学实验是研究免疫系统功能、抗体与抗原相互作用以及免疫相关疾病诊断与治疗的重要手段。为确保实验结果的准确性、可重复性，并保障操作人员的安全，制定标准化的实验流程操作规范至关重要。本规范涵盖免疫学实验的各个环节，包括样品准备、试剂配制、实验操作、数据分析及废弃物处理等，旨在提供系统化的指导。

二、实验准备阶段

（一）样品准备

1.血清或血浆样品：采集后立即离心（3000rpm，5分钟），取上清液置于EP管中，-20℃保存。

2.细胞样品：用PBS缓冲液洗涤细胞2次，重悬于含1%BSA的封闭液中。

3.组织样品：新鲜组织用4%多聚甲醛固定24小时，随后梯度脱水、石蜡包埋。

（二）试剂配制

1.缓冲液：常用PBS（pH7.4）、TBST（含0.05%Tween-20的PBS）。

2.封闭液：5%脱脂奶粉或1%BSA的PBS溶液。

3.抗体工作浓度：根据说明书稀释，通常为1:1000~1:5000。

（三）仪器设备检查

1.超净工作台：每日使用前紫外线消毒30分钟，确保工作台内菌落计数100CFU/皿。

2.酶标仪：校准波长准确性（450nm、550nm），确保吸光度读数范围在0.1~2.0OD。

三、核心实验操作

（一）酶联免疫吸附试验（ELISA）

1.微孔板处理：用300μL封闭液封闭96孔板，4℃孵育2小时。

2.抗原包被：移除封闭液，加入100μL抗原（1μg/mL），37℃孵育1小时。

3.洗涤：用TBST洗涤3次，每次300μL。

4.一抗孵育：加入100μL稀释的一抗，37℃孵育1小时。

5.洗涤：同上步骤。

6.二抗孵育：加入100μL稀释的二抗（HRP标记），37℃孵育1小时。

7.洗涤：同上步骤。

8.底物显色：加入100μLTMB底物，室温避光反应30分钟。

9.终止反应：加入50μL2MH?SO?终止反应。

10.结果检测：酶标仪读取450nm波长吸光度值。

（二）流式细胞术（FCM）操作

1.细胞染色：

(1)细胞固定：用4%多聚甲醛固定细胞，室温30分钟。

(2)封闭：加入PBS含1%FBS，避光孵育15分钟。

(3)染色：加入荧光标记抗体（如CD3-PE），4℃孵育30分钟。

2.流式细胞仪设置：

(1)设定门控区域，排除细胞碎片。

(2)调整荧光补偿，确保信号准确。

3.数据采集：单个细胞计数≥10,000个，采集时间≥1分钟。

（三）免疫荧光（IF）染色

1.组织切片：切片厚度5μm，60℃干燥30分钟。

2.抗原修复：用EDTA抗原修复液热修复，高压锅10分钟。

3.封闭：用10%山羊血清封闭1小时。

4.一抗孵育：滴加稀释的一抗（1:100），4℃过夜。

5.洗涤：PBS洗涤3次，每次5分钟。

6.二抗孵育：滴加稀释的二抗（AlexaFluor标记），37℃30分钟。

7.洗涤：同上步骤。

8.盖片：滴加抗荧光淬灭封片剂，封片膜封存。

9.成像：使用荧光显微镜（Ex/Em：488/515nm，550/590nm）。

四、数据记录与处理

（一）原始数据记录

1.ELISA：记录孔板编号、吸光度值、重复孔均值及标准差。

2.FCM：导出FCS文件，记录细胞群比例、荧光强度中位数。

3.IF：拍照时设置统一曝光时间，保存高分辨率图像。

（二）统计分析

1.ELISA：使用GraphPadPrism计算IC50值，p0.05为差异有统计学意义。

2.FCM：通过FlowJo软件分析细胞亚群分布，设门误差5%。

3.IF：使用ImageJ软件量化蛋白表达强度，每张切片分析≥50个细胞。

五、实验废弃物处理

（一）生物安全

1.液体废弃物：含细胞或抗体的溶液用10%次氯酸钠消毒30分钟后统一处理。

2.固体废弃物：切片刀片、培养皿等锐器放入专用锐器盒。

（二）化学试剂

1.底物溶液：TMB废液用酸中和后排放，pH调至6~8。

2.荧光染料：荧光标记抗体废液需高压灭菌，避免光分解。

（三）规范执行

1.实验结束后，超净工作台使用70%酒精擦拭表面。

2.废弃物分类存放，实验室每日清洁消毒。

六、注意事项

1.操作时佩戴手套，避免交叉污染。

2.弱碱性试剂（如抗体）需用酸度计校准pH值（6.5~7.5）。

3.流式细胞仪每日校准荧光通道，确保线性范围在100~10,000arbitraryunits。

4.免疫荧光实验避免激光过度曝光，防止荧光淬灭。

本规范旨在提供免疫学实验的标准操作流程，具体步骤可根据实验目的和试剂特性适当调整，但需确保所有操作符合实验室安全及质量控制要求。

**一、免疫学实验流程