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免疫学实验手册

一、实验概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构、功能及其与外界环境相互作用的科学方法。本手册旨在提供一套系统化、标准化的实验流程，帮助实验人员掌握基础免疫学实验技术，确保实验结果的准确性和可重复性。

二、实验准备

（一）实验器材

1.移液器（10μL~1000μL）

2.离心机（高速冷冻离心机，转速范围10000~20000rpm）

3.电子天平（精度0.1mg）

4.恒温培养箱（37℃±0.5℃）

5.超净工作台（紫外杀菌灯、风淋系统）

6.酶标仪（波长范围450~630nm）

7.pH计（精度±0.1）

（二）实验试剂

1.PBS缓冲液（pH7.4）

2.蛋白质浓度测定试剂盒（Bradford法）

3.细胞培养基（如DMEM/F12，含10%FBS）

4.酶联免疫吸附剂（ELISA）试剂盒

5.荧光标记抗体（如CD3-PE、CD4-FITC）

6.细胞裂解液（RIPA缓冲液）

（三）实验耗材

1.96孔酶标板

2.移液吸头（不同规格）

3.无菌离心管（1mL、5mL、50mL）

4.微量离心管（0.2μL、0.5μL）

5.封口膜（透气性）

三、基础免疫学实验方法

（一）细胞培养实验

1.细胞复苏

(1)将冻存细胞置于37℃水浴中快速解冻。

(2)加入预温培养基（含10%FBS）重悬细胞。

(3)移入培养瓶，37℃、5%CO?培养箱中培养。

2.细胞计数

(1)使用血球计数板，加入0.4%台盼蓝染液。

(2)计算活细胞比例（台盼蓝排除法）。

(3)调整细胞密度至1×10?/mL。

（二）ELISA实验

1.试剂准备

(1)将ELISA试剂盒用PBS稀释至工作浓度。

(2)预温所有试剂及酶标板（37℃，30分钟）。

2.样本加样

(1)每孔加入100μL标准品或样本。

(2)加封闭液（如5%BSA），37℃封闭1小时。

3.检测步骤

(1)弃封闭液，加入100μL生物素化抗体，37℃孵育1小时。

(2)洗涤（PBST洗液，×3次，每次5分钟）。

(3)加入100μL辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，37℃孵育1小时。

(4)洗涤（同上）。

(5)加入显色液（TMB底物），室温避光反应30分钟。

4.结果测定

(1)加入终止液（2MH?SO?），终止反应。

(2)酶标仪检测OD值（450nm）。

(3)计算样本浓度（通过标准曲线）。

（三）流式细胞术实验

1.细胞染色

(1)收集单细胞悬液，PBS洗涤1次。

(2)加入固定液（如4%多聚甲醛），4℃固定30分钟。

(3)PBS洗涤，加入破膜液（含0.1%NP-40），室温孵育30分钟。

(4)加入荧光抗体（如CD8-APC），4℃避光孵育30分钟。

2.数据采集

(1)流式细胞仪设门（去除细胞碎片）。

(2)收集10?~10?个事件，流速设为100个/秒。

(3)保存原始数据（FCS格式）。

四、实验安全与注意事项

（一）生物安全

1.操作时佩戴手套、口罩、护目镜。

2.使用酒精灯消毒操作台面。

3.细胞培养需在超净工作台进行。

（二）试剂处理

1.强酸强碱需佩戴耐酸碱手套。

2.荧光抗体避光保存，避免光漂白。

（三）数据记录

1.及时记录实验参数（温度、pH、时间）。

2.原始数据备份至专用硬盘。

五、质量控制

（一）细胞实验

1.每次实验设置阴性对照（无细胞培养基）。

2.细胞活力需≥90%（台盼蓝染色法）。

（二）ELISA实验

1.重复孔变异系数（CV）≤10%。

2.标准曲线R2值≥0.95。

（三）流式细胞术

1.设门前后细胞纯度≥95%。

2.荧光强度线性范围（FL1~FL4）。

六、实验总结

免疫学实验涉及多个技术环节，需严格遵循标准化流程。本手册提供的基础方法适用于常规免疫学研究，实验人员可根据具体需求调整参数。定期校准仪器、规范操作是保证实验结果可靠性的关键。

一、实验概述

免疫学实验是研究机体免疫系统结构、功能及其与外界环境相互作用的科学方法。本手册旨在提供一套系统化、标准化的实验流程，帮助实验人员掌握基础免疫学实验技术，确保实验结果的准确性和可重复性。免疫学实验广泛应用于生命科学研究的多个领域，如疾病诊断、药物研发、疫苗制备等。通过规范化的操作，可以最大程度地减少实验误差，提高研究效率。

二、实验准备

（一）实验器材

1.移液器（10μL~1000μL）：选择合适量程的移液器，确保刻度清晰，活塞顺畅。定期使用酒精棉片清洁移液器枪头，避免交叉污染。

2.离心机（高速冷冻离心机，转速范围10000~20000rpm）：开机前检查转子是否安装牢固，离心管是否平衡。高