过氧化物酶同工酶的提取分离.pptVIP

2.3浓缩胶的制备：按下表制备浓缩胶试剂名称浓缩胶缓冲液浓缩胶丙胶贮液Ap蔗糖体积比1222取用量1222用滤纸吸干水→倒入浓缩胶→插入梳子→封水，照光→当胶色由黄变为乳白色表明聚合好。第29页，共36页，星期日，2025年，2月5日3、酶液的制备：称取大麦幼苗茎部1g→加样品提取液1ml→于冰浴中研成匀浆→然后以2ml提取液分几次洗入离心管→在高速离心机上以4000转/每分钟，离心10min→倒出上清液，以等量40%蔗糖混合→低温放置待用。第30页，共36页，星期日，2025年，2月5日4.1装槽：取出胶板下端胶条→用滤纸擦净凡士林油→将胶板固定在电泳槽上（凹板一侧向内）→上下槽装电极缓冲液。第31页，共36页，星期日，2025年，2月5日第32页，共36页，星期日，2025年，2月5日4.2点样：轻拔电泳梳子→用微量进样器点样→每孔约30μl。第33页，共36页，星期日，2025年，2月5日5、电泳：接通电源→稳流→调节电流到每孔1mA左右→当溴酚蓝前沿进入分离胶后，可适当加大电流→待前沿下行到距胶末1cm处，停止电泳。第34页，共36页，星期日，2025年，2月5日第1页，共36页，星期日，2025年，2月5日1、掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理和方法；2、掌握过氧化物酶(POD)活性测定的原理及方法。3、了解过氧化物酶(POD)的生物学功能。一、实验目的：第2页，共36页，星期日，2025年，2月5日1、过氧化物酶：过氧化物酶广泛存在于植物体中，是活性较高的一种酶。它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。一般老化组织中活性较高，幼嫩组织中活性较弱。这是因为过氧化物酶能使组织中所含的某些碳水化合物转化成木质素，增加木质化程度，而且发现早衰减产的水稻根系中过氧化物酶的活性增加，所以过氧化物酶可作为组织老化的一种生理指标。此外，过氧化物同工酶在遗传育种中的重要作用也正在受到重视。二、实验原理:第3页，共36页，星期日，2025年，2月5日2、同工酶概念：同工酶指催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。同工酶与生物的遗传，生长发育，代谢调节及抗性等都有一定的关系，如POD在细胞代谢过程中与呼吸作用，光合作用，及生长素的氧化等都有关系，测定POD活性或其同工酶，可以反映某一时期植物体内代谢变化。二、实验原理:第4页，共36页，星期日，2025年，2月5日(1)定义：是指带电粒子在电场中向与其自身所带电荷相反的电极方向移动的现象。(2)影响电泳效果的因素：①带电颗粒的大小和形状：颗粒越大，电泳速度越慢，反之越快；②颗粒的电荷数：电荷越少，电泳速度越慢，反之越快；③溶液的粘度：粘度越大，电泳速度越慢，反之越快；3、电泳：第5页，共36页，星期日，2025年，2月5日④溶液的pH值：影响被分离物质的解离度，离等电点越近，电泳速度越慢，反之越快；⑤电场强度：电场强度越小，电泳速度越慢，反之越快；⑥离子强度：离子强度越大，电泳速度越慢，反之越快；⑦电渗现象：电场中，液体相对于固体支持物的相对移动；⑧支持物筛孔大小：孔径小，电泳速度慢，反之则快。续(2)影响电泳效果的因素：第6页，共36页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯酰胺凝胶电泳是以聚丙烯胺凝胶作为载体的一种区带电泳。4、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）第7页，共36页，星期日，2025年，2月5日聚丙烯胺凝胶由丙烯酰胺单体（Acr）和N，N’-甲叉双丙烯酰胺（Bis）在催化剂作用下聚合而成。在具有自由基时，Acr和Bis就会聚合。引发产生自由基的方法有两种：①化学法②光聚合法(1)聚丙烯胺凝胶的生成：第8页，共36页，星期日，2025年，2月5日①化学聚合：引发剂是过硫酸铵(AP)，催化剂N、N、N’、N’－四甲基乙二胺（TEMED），它的碱基催化AP产生氧自由基，激活单体形成自由基，发生聚合。化学聚合形成的凝胶孔径较小，且重复性好，用来制备分离胶；②光聚合：催化剂是核黄素（VB2），在痕量氧存在下，核黄素