基于CRISPR_Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中的构建及功能拓展研究.docxVIP

基于CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中的构建及功能拓展研究

一、引言

1.1研究背景

基因组编辑技术作为现代生命科学领域的关键技术，自问世以来便引发了广泛关注并取得了飞速发展。从早期的同源重组技术，到后来的锌指核酸酶（ZFN）技术、转录激活因子样效应物核酸酶（TALEN）技术，再到如今广泛应用的规律成簇间隔短回文重复（CRISPR）/Cas系统，每一次技术的革新都为基因功能研究、疾病治疗、作物遗传改良等领域带来了新的契机。其中，CRISPR/Cas9系统凭借其操作简便、成本低廉、编辑效率高以及可同时对多个基因进行编辑等显著优势，迅速成为了基因组编辑领域的研究热点，在人类和其它哺乳动物细胞基因编辑中取得了众多成果，如在癌症治疗方面，通过编辑肿瘤相关基因，有望实现对癌症的精准治疗；在遗传病治疗领域，也展现出巨大的潜力，为攻克一些传统医学难以治愈的遗传性疾病带来了希望。

CRISPR/Cas9系统在微生物基因编辑领域同样具有重要的应用价值。微生物作为地球上最为丰富多样的生物群体之一，在工业生产、环境保护、食品发酵等诸多领域发挥着关键作用。通过对微生物基因的精准编辑，可以优化微生物的代谢途径，提高目标产物的产量和质量，赋予微生物新的功能，从而满足不同领域的需求。地衣芽胞杆菌DW2作为一种具有重要工业应用价值的革兰氏阳性细菌，能够产生多种生物活性物质，如淀粉酶、蛋白酶、杆菌肽等，在食品、饲料、医药等行业具有广泛的应用前景。然而，目前对其遗传操作的研究仍相对滞后，传统的基因编辑方法存在效率低、操作复杂等问题，限制了对其基因功能的深入研究和应用开发。因此，构建高效的基因编辑系统对于地衣芽胞杆菌DW2的研究和应用具有至关重要的意义。CRISPR/Cas9n系统作为CRISPR/Cas9系统的一种变体，具有独特的优势，为地衣芽胞杆菌DW2的基因编辑提供了新的策略和方法。深入研究CRISPR/Cas9n系统在地衣芽胞杆菌DW2中的构建及其应用，不仅有助于拓展CRISPR技术在微生物领域的应用范围，也将为地衣芽胞杆菌DW2的遗传改造和工业应用提供有力的技术支持，具有重要的理论意义和实际应用价值。

1.2CRISPR/Cas9n系统研究进展

CRISPR的发现可以追溯到20世纪80年代末，西班牙科学家FranciscoMojica在研究地中海嗜盐菌时，首次发现了细菌基因组中存在一些间隔排列的重复序列，但当时并未明确其功能。此后，随着研究的不断深入，科学家们在越来越多的细菌和古菌中发现了类似的序列，并将其命名为规律成簇间隔短回文重复序列（CRISPR）。2005年，研究人员发现CRISPR中的间隔序列与噬菌体或质粒的DNA序列相匹配，从而揭示了CRISPR与细菌免疫防御之间的关系。2007年，Danisco公司的研究人员首次证实CRISPR系统可以作为细菌的一种获得性免疫机制，能够防御外来遗传物质的侵入。2012年，JenniferDoudna和EmmanuelleCharpentier等研究人员成功解析了CRISPR-Cas9系统的功能机制，发现Cas9蛋白可以在RNA分子的引导下，识别并切割特定的DNA序列，这一发现标志着CRISPR技术在精确基因编辑方面的巨大潜力被正式揭示，从此CRISPR技术在基因编辑领域迅速崛起并得到广泛应用。

根据其功能元件的不同，CRISPR/Cas系统主要分为两大类。第一类系统需要多种蛋白质共同作用来切割核酸，包括I型、III型和IV型三个亚型；第二类系统则仅使用一种效应蛋白，包括II型、V型和VI型三个亚型。其中，Cas9属于第二类II型CRISPR系统，是目前基因编辑疗法中应用最为广泛的工具。在自然状态下，CRISPR/Cas系统是原核生物的一种适应性免疫系统，用于抵御病毒和质粒等外源遗传物质的入侵。当病毒首次入侵细菌时，Cas蛋白会识别病毒DNA中的原间隔序列邻近基序（PAM），并将病毒DNA切割成原间隔序列，然后将其整合到细菌基因组的CRISPR阵列中，形成间隔序列。间隔序列之间由短回文重复序列分隔。当病毒再次侵染时，CRISPR阵列会转录成前体CRISPRRNA（pre-crRNA），在II型系统中，反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）与前体crRNA结合，形成双链RNA，随后被RNaseIII加工成成熟的crRNA和tracrRNA。crRNA包含来自先前感染的间隔序列，与tracrRNA和Cas蛋白形成复合物，该复合物能够识别并结合入侵病毒DNA上与crRNA