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细胞染色与显微镜观察操作标准流程

引言

细胞作为生命活动的基本结构和功能单位，其形态特征、内部结构及特定成分的分布对于理解生命过程、疾病机制及药物效应等具有至关重要的意义。细胞染色技术与显微镜观察是揭示这些微观世界奥秘的核心手段。通过特定的染色方法，可以选择性地凸显细胞内的不同结构或化学成分，使其在显微镜下呈现出清晰可辨的形态与色彩差异。本标准流程旨在规范细胞染色与显微镜观察的操作步骤，确保实验结果的准确性、可重复性与可靠性，同时保障实验操作的安全性。

一、实验前准备

1.1实验环境与个人防护

实验操作应在洁净、通风的实验台进行。操作人员需穿着实验服，佩戴一次性手套及防护眼镜，长发者需束发。实验台面需用75%乙醇擦拭消毒，确保无灰尘、无污染。

1.2实验器材与试剂准备

1.2.1器材准备与检查

*显微镜：检查显微镜各部件是否完好，镜头是否清洁，光源是否正常，调焦系统是否顺畅。使用前需进行必要的清洁和调试。

*载玻片与盖玻片：确保玻片清洁、无划痕、无裂纹。必要时，可用无水乙醇擦拭并晾干。

*染色缸：根据实验需求准备不同规格的染色缸，用于浸染操作。

*移液器与吸头：选择合适量程的移液器，配套使用无酶、无热源的一次性吸头。

*滴管、烧杯、镊子、刀片、滤纸、计时器等：按需准备，并确保洁净。

*其他：如湿盒（用于避光、保湿染色）、擦镜纸、香柏油（用于油镜观察）等。

1.2.2试剂准备与检查

*细胞样本：根据实验目的准备相应的细胞爬片、细胞涂片或组织切片。确保样本标记清晰，状态良好。

*固定液：如甲醇、乙醇、甲醛溶液等，需确认其有效期及浓度是否符合实验要求。

*染色液：如苏木素-伊红（HE）染液、吉姆萨染液、荧光染料（如DAPI、FITC标记抗体等）。检查染色液是否在有效期内，是否有沉淀或变色，必要时进行过滤。荧光染料需注意避光保存和使用。

*洗涤液：如磷酸缓冲盐溶液（PBS）、Tris缓冲液（TBS）等，确认其pH值及渗透压是否适宜，是否现配现用或妥善保存。

*封片剂：根据染色类型选择合适的封片剂，如中性树胶（用于常规染色）、抗荧光淬灭封片剂（用于荧光染色）。

*其他辅助试剂：如通透剂（TritonX-100等）、封闭液（BSA、血清等，用于免疫染色）。

二、细胞染色操作流程

2.1样本制备（以细胞爬片为例）

*对于贴壁细胞爬片，取出培养板，用PBS洗涤2-3次，以去除培养基残留。

*对于悬浮细胞，可通过离心涂片或cytospin甩片机制备细胞涂片。

*对于组织切片，通常已完成脱蜡至水步骤（若为石蜡切片）。

2.2固定（若需）

*根据实验要求选择合适的固定液。例如，HE染色常用4%多聚甲醛或10%中性缓冲福尔马林固定15-30分钟；甲醇/乙醇固定常用于细胞核染色或某些抗原的保存。

*固定液应充分覆盖样本。固定时间和温度需严格控制，避免过度固定或固定不足。

*固定完成后，用相应的洗涤液（如PBS）洗涤2-3次，每次3-5分钟，以去除残留固定液。

2.3通透（若需）

*对于需要检测细胞内抗原或细胞核内成分的染色（如免疫荧光），通常需要进行细胞膜通透处理。

*常用0.1%-0.5%TritonX-100（溶于PBS或TBS中）室温孵育5-15分钟。

*通透后用洗涤液洗涤2-3次，每次3-5分钟。

2.4封闭（若需，主要用于免疫染色）

*为减少非特异性结合，在加入一抗前需进行封闭。

*常用封闭液为含1%-5%BSA或相应正常血清（与二抗来源一致）的PBS或TBS，室温封闭30分钟至1小时。

*封闭液应完全覆盖样本。封闭后一般无需洗涤，直接吸去多余液体即可进行下一步。

2.5染色

2.5.1常规染色（如HE染色）

*苏木素染色：将样本浸入苏木素染液中，染色时间根据染液新旧、样本类型及实验要求而定，通常为5-15分钟。新手可在显微镜下观察染色程度。

*水洗：流水冲洗，去除多余染液。

*分化（若需）：用1%盐酸乙醇分化数秒至数十秒，迅速水洗终止分化，直至细胞核呈清晰的蓝紫色。

*返蓝（若需）：用弱碱性溶液（如自来水、稀氨水）返蓝数分钟，使细胞核着色更鲜艳。

*伊红染色：将样本浸入伊红染液中，染色时间通常为1-5分钟，使细胞质着色。

*脱水、透明：依次经梯度乙醇（70%、80%、95%、无水乙醇I、无水乙醇II）脱水，每步1-3分钟；再经二甲苯I、二甲苯II透明，每步1-3分钟。

2.5.2荧光染色（以DAPI细胞核染色为例）

*用PBS稀释DAPI染液至工作浓度（通常为1-5μg/ml）。

*将稀释好的DAPI染液滴加于样本上