毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库构建、筛选及动力蛋白基因表达研究.docxVIP

毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库构建、筛选及动力蛋白基因表达研究

一、引言

1.1研究背景与意义

鸡球虫病是一种由艾美耳属球虫寄生于鸡肠道引起的全球性寄生虫病，给养鸡业带来了巨大的经济损失。美国每年因球虫病造成的经济损失高达6.4亿美元，1998年我国用于防治鸡球虫病的费用可达3.1-6.2亿元人民币。在鸡的七种艾美耳球虫中，毒害艾美耳球虫（Eimerianecatrix）的致病力仅次于柔嫩艾美耳球虫（Eimeriatenella），是引发鸡急性小肠球虫病的重要病原体。近年来，广东省肉鸡群中由毒害艾美耳球虫引起的急性小肠球虫病流行率逐年升高，严重影响了养鸡业的发展。

由于毒害艾美耳球虫自身的生物学特点，如卵囊活力较弱、繁殖能力较低，以及抗药性问题日益严重，使得大多数抗球虫药对该虫种的防治效果不理想，这给毒害艾美耳球虫病的防治带来了严峻挑战。因此，深入研究毒害艾美耳球虫的致病机制，开发有效的防治措施迫在眉睫。

构建cDNA文库是研究基因表达和功能的重要手段，通过构建毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库，可以筛选出与该虫致病、发育等相关的重要基因，为揭示其致病机制提供分子基础。同时，动力蛋白基因在细胞运动、物质运输等过程中发挥着关键作用，研究毒害艾美耳球虫动力蛋白基因的表达，有助于深入了解该虫的生物学特性，为开发新的防治策略提供理论依据。此外，筛选出的基因还可能作为潜在的疫苗候选抗原，为鸡球虫病的免疫预防提供新的思路和方法，对于减少养鸡业因球虫病造成的经济损失具有重要的现实意义。

1.2国内外研究现状

在国外，对鸡球虫的研究开展较早，已经在球虫的分类、生物学特性、致病机制等方面取得了一定的成果。在cDNA文库构建方面，已经建立了柔嫩艾美耳球虫、堆形艾美耳球虫等不同发育阶段的cDNA文库，并从文库中筛选出了多种重要抗原基因，为研究球虫的分子疫苗和探索基因功能奠定了基础。然而，针对毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建及相关研究相对较少。

在国内，对鸡球虫病的研究也在不断深入。近年来，在球虫的流行病学调查、诊断方法、防治技术等方面取得了一些进展。在cDNA文库构建方面，也有学者进行了相关研究，如构建了堆形艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库、巨型艾美耳球虫孢子化卵囊cDNA文库等。但对于毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建及筛选，以及动力蛋白基因表达的研究还不够系统和深入。

当前研究的不足主要体现在对毒害艾美耳球虫的分子生物学研究相对薄弱，尤其是在配子体阶段的基因表达和功能研究方面存在较大空白。本研究将以毒害艾美耳球虫配子体为研究对象，构建cDNA文库并进行筛选，同时对动力蛋白基因的表达进行分析，有望填补这一领域的部分空白，为鸡球虫病的防治提供新的理论和技术支持。

1.3研究目标与内容

本研究的主要目标是成功构建毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库，并从中筛选出具有重要功能的基因，同时对动力蛋白基因的表达进行系统分析，为揭示毒害艾美耳球虫的致病机制和开发新型防治策略提供理论依据和实验基础。

围绕上述目标，本研究的具体内容包括以下几个方面：首先，进行毒害艾美耳球虫配子体的收集与处理，通过优化实验条件，获取高质量的配子体样本，为后续cDNA文库的构建提供优质材料；其次，采用先进的分子生物学技术，构建毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库，并对文库的质量进行严格检测，确保文库的完整性、代表性和高重组率；接着，运用免疫学筛选、功能筛选等多种方法，从构建的cDNA文库中筛选出与毒害艾美耳球虫致病、发育等相关的基因，并对这些基因进行生物信息学分析，初步了解其结构和功能；最后，以筛选出的动力蛋白基因作为重点研究对象，利用实时荧光定量PCR、Westernblot等技术，研究该基因在毒害艾美耳球虫不同发育阶段的表达水平变化，以及在不同外界条件刺激下的表达调控机制，深入探讨动力蛋白基因在毒害艾美耳球虫生物学过程中的作用。

二、毒害艾美耳球虫配子体cDNA文库的构建

2.1材料准备

本研究选用的毒害艾美耳球虫虫株由[具体来源，如某专业的寄生虫保藏中心或实验室分离保存]提供，确保虫株的纯度和活性。实验动物为[品种、日龄等详细信息]的SPF（无特定病原体）鸡，购自[供应商名称]，饲养于严格控制环境条件的动物房中，以保证其未感染其他病原体，避免对实验结果产生干扰。

主要试剂包括TRI-ZOL试剂（购自[试剂品牌]公司），用于提取总RNA；Oligo(dT)纤维素柱（[品牌]），用于分离mRNA；反转录试剂盒（[品牌]），用于合成cDNA；DNA连接酶、限制性内切酶（[品牌]），用于cDNA与载体的连接和酶切反应；噬菌体包装蛋白（[品牌]），用于