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莪术醇对人脑胶质瘤细胞增殖与凋亡影响的实验研究

一、实验材料

（一）细胞株

人脑胶质瘤细胞株（U87、U251），购自中国科学院上海细胞库。

（二）主要试剂

莪术醇（纯度≥98%），购自Sigma-Aldrich公司；DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS），购自Gibco公司；胰蛋白酶（0.25%）、青霉素-链霉素混合液，购自HyClone公司；CellCountingKit-8（CCK-8）试剂盒，购自Dojindo公司；AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒，购自BDBiosciences公司；Bax、Bcl-2、Caspase-3抗体，购自Abcam公司；β-actin抗体，购自SantaCruz公司；辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗，购自JacksonImmunoResearch公司；ECL化学发光试剂盒，购自Millipore公司。

（三）主要仪器

CO?培养箱（ThermoFisherScientific）；倒置显微镜（Olympus）；酶标仪（BioTek）；流式细胞仪（BDFACSCantoII）；Westernblot电泳仪及转膜仪（Bio-Rad）。

二、实验方法

（一）细胞培养

将人脑胶质瘤细胞株U87、U251接种于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的DMEM高糖培养基中，置于37℃、5%CO?的培养箱中培养。当细胞融合度达到80%-90%时，用0.25%胰蛋白酶消化传代，取对数生长期细胞进行实验。

（二）CCK-8法检测细胞增殖

取对数生长期的U87、U251细胞，以每孔5×103个细胞的密度接种于96孔板中，每孔体积100μL，培养24h后，分别加入不同浓度（0、25、50、100、200μmol/L）的莪术醇，每个浓度设3个复孔。继续培养24、48、72h后，每孔加入10μLCCK-8溶液，置于培养箱中孵育2h，用酶标仪在450nm波长处测定各孔的吸光度（OD值）。计算细胞增殖抑制率，公式为：细胞增殖抑制率（%）=（1-实验组OD值/对照组OD值）×100%。根据抑制率计算莪术醇对两种细胞的半数抑制浓度（IC50）。

（三）流式细胞术检测细胞凋亡

取对数生长期的U87、U251细胞，以每孔2×10?个细胞的密度接种于6孔板中，培养24h后，加入0、50、100μmol/L的莪术醇（根据CCK-8结果选取合适浓度），继续培养48h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，离心（1000r/min，5min），弃上清。按照AnnexinV-FITC/PI凋亡检测试剂盒说明书操作，加入5μLAnnexinV-FITC和5μLPI，避光孵育15min，立即用流式细胞仪检测细胞凋亡率。

（四）Westernblot检测相关蛋白表达

取对数生长期的U87、U251细胞，以每孔5×10?个细胞的密度接种于6孔板中，培养24h后，加入0、50、100μmol/L的莪术醇，继续培养48h。收集细胞，用预冷的PBS洗涤2次，加入RIPA裂解液（含PMSF），冰上裂解30min，离心（12000r/min，4℃，15min），取上清，用BCA蛋白定量试剂盒测定蛋白浓度。取等量蛋白（50μg）进行SDS电泳，然后转至PVDF膜上。用5%脱脂奶粉封闭2h，加入一抗（Bax1:1000、Bcl-21:1000、Caspase-31:1000、β-actin1:5000），4℃孵育过夜。次日，用TBST洗涤3次，每次10min，加入HRP标记的二抗（1:5000），室温孵育1h，TBST洗涤3次，每次10min。最后，用ECL化学发光试剂盒显影，ImageJ软件分析蛋白条带的灰度值，以β-actin为内参，计算各蛋白的相对表达量。

（五）统计学分析

所有实验数据均以均数±标准差（x±s）表示，采用SPSS22.0统计学软件进行分析。多组间比较采用单因素方差分析（ANOVA），组间两两比较采用LSD-t检验。P0.05为差异具有统计学意义。

三、实验结果

（一）莪术醇对人脑胶质瘤细胞增殖的影响

CCK-8法检测结果显示，随着莪术醇浓度的增加和作用时间的延长，U87、U251细胞的增殖抑制率均逐渐升高，呈浓度和时间依赖性（P0.05）。莪术醇作用24、48、72h后，对U87细胞的IC50分别为156.32、98.75、65.21μmol/L；对U251细