培训一各种引物设计.pptVIP

培训大纲

一引物设计

1.普通基因或者片段扩增引物

2.荧光定量PCR引物

3.适用于酶切载体构建和Gateway载体构建的引物设计

4.RNAi载体构建的引物

5.亚细胞定位的载体构建

二基因克隆

1.普通PCR

2.长片段及短片段克隆

3.平末端，黏性末端克隆

三TA克隆，Ecoil转化

四质粒提取

五载体构建

1.酶切载体构建及验证

2.Gateway载体构建及验证

3.农杆菌转化（发根，根癌）

六转基因及功能验证

七苜蓿毛状根转化

八菌根染色观察，显微镜使用

现在是1页\一共有27页\编辑于星期六

基因定义

基因组DNA

cDNA

RNA提取

现在是2页\一共有27页\编辑于星期六

1.家族基因。

是指具有相同功能的，不同基因。

2.转录本。

是指一个基因有两个不同的转录结果。都来自于一个基因，由于选择性剪切导致的。

现在是3页\一共有27页\编辑于星期六

基因扩增PCR

体系：酶，缓冲液Buffer,dNTP,MgCl2,引物F，R。Forward,Re

F引物

R引物

现在是4页\一共有27页\编辑于星期六

流程

1.模板准备，引物准备

2.PCR扩增

3.片段回收

4.连接TA克隆

5.转化大肠杆菌

6.测序，确定序列

7.提质粒，保存菌液（15%-30%甘油）

现在是5页\一共有27页\编辑于星期六

序列寻找

参考基因组网站：甜橙（Citrussinensis）。

柑橘菌根模式：枳壳（Poncirustrif.），做为砧木，使用范围最广，抗寒。

苜蓿基因组：

/cgi-bin/medicago/overview.cgi。

基因研究情况。

现在是6页\一共有27页\编辑于星期六

1.枳壳中基因，做亚细胞定位

克隆启动子（用DNA）ATG前2kb，基因序列（用RNA反转录的cDNA）。

2.对应到苜蓿中基因，做RNAi功能验证，荧光定量PCR验证。（用cDNA克隆）

现在是7页\一共有27页\编辑于星期六

引物设计原则

1、长度：15—30bp，其有效长度[Ln=2(G十C)十(A十T)]一般不大于38，否则PCR的最适延伸温度会超过Taq酶的最佳作用温度(74度)，从而降低产物的特异性。

2、G十c含量：应在40%一60%之间，PCR扩增中的复性温度一般是较低Tm值引物的Tm值减去5—10度。引物长度小于20时，其Tm恒等于4×(G十C)十2×(A十T)。

3.Tm53-60

3、碱基分布的随机性：应避免连续出现4个以上的单一碱基。尤其是不应在其3’端出现超过3个的连续G或C，否则会使引物在G十C富集序列区错误引发。

4、引物自身：不能含有自身互补序列，否则会形成发夹样二级结构。

5、引物之间：两个引物之间不应有多于4个的互补或同源碱基，不然会形成引物二聚体，尤应避免3’端的互补重叠。

6、上下游引物的互补性：一个引物的3‘末端序列不允许结合到另一个引物的任何位点上。

7、3’末端：如果可能的话，每个引物的3‘末端碱基应为G或C。

8、引物应当超出限制性内切酶识别位点至少3个核苷酸。

示范。。。最普通的PCR引物设计。。。

现在是8页\一共有27页\编辑于星期六

现在是9页\一共有27页\编辑于星期六

荧光定量PCR引物设计

1.Tm60度。

2.片段特异性。在基因组上，仅存在这一条片段，只能扩出这一条片段。选取3‘UTR区域。

3.片段长度在60-100bp左右。

现在是10页\一共有27页\编辑于星期六

酶切法构建载体

现在是11页\一共有27页\编辑于星期六

1.选择载体上的酶切位点。保证所需要的基因片段中不包含此酶切位点。

2.添加酶切位点和保护碱基。都添加到引物的5’端。

现在是12页\一共有27页\编辑于星期六

Topo克隆

现在是13页\一共有27页\编辑于星期六

现在是14页\一共有27页\编辑于星期六

现在是15页\一共有27页\编辑于星期六

现在是16页\一共有27页\编辑于星期六

Gateway反应

现在是17页\一共有27页\编辑于星期六

现在是18页\一共有27页\编辑于星期六

RNAi

现在是19页\一共有27页\编辑于星期六

现在是20页\一共有27页\编辑于星期六

现在是21页\一共有27页\编辑于星期六

超表达载体

现在是22页\一共有27页\编辑于星期六

RNAi引物设计

1.片段长度：在300-500bp比较好。

2.序列必须特异。特异到，20-21bp都没有和其它基因匹配上的。

现在是23页\一共有27页\编辑于星期六

现在是24页\一共有27页\编辑于星期六

现在是25页\一