基于转录组分析揭示六个小麦抗叶锈病近等基因系mRNA表达差异及抗病机制.docxVIP

基于转录组分析揭示六个小麦抗叶锈病近等基因系mRNA表达差异及抗病机制

一、引言

1.1研究背景

小麦（TriticumaestivumL.）作为全球最重要的粮食作物之一，其产量和质量对保障世界粮食安全起着关键作用。然而，小麦生产面临着诸多生物和非生物胁迫，其中小麦叶锈病是影响小麦产量和品质的重要生物灾害之一。

小麦叶锈病是由小麦叶锈菌（Pucciniatriticina）引起的一种全球性病害，具有传播速度快、流行范围广的特点。在适宜的环境条件下，叶锈菌能够迅速侵染小麦植株，导致叶片出现大量锈斑，严重影响小麦的光合作用和正常生长发育。据统计，在叶锈病大流行年份，小麦减产可达30%以上，甚至绝收，给农业生产带来巨大的经济损失。

长期以来，防治小麦叶锈病主要依赖化学药剂，但化学防治不仅增加生产成本，还会对环境造成污染，同时可能导致病原菌产生抗药性。因此，培育和利用抗病品种被认为是防治小麦叶锈病最经济、有效和环保的方法。小麦抗叶锈病基因的研究对于培育抗病品种至关重要，通过深入了解抗叶锈病基因的功能和作用机制，可以为小麦抗病育种提供理论基础和基因资源。

近等基因系（Near-isogeniclines，NILs）是指遗传背景相同或相近，仅在个别基因位点上存在差异的一组品系。利用小麦抗叶锈病近等基因系研究mRNA表达差异，能够排除遗传背景干扰，准确鉴定与抗叶锈病相关的基因，揭示小麦抗叶锈病的分子机制，为小麦抗病育种提供新的思路和方法。

1.2小麦抗叶锈病基因研究进展

自1946年Allan等首次将小麦品种Malakof、Webster、Fullcaster中的抗叶锈病基因分别定名为Lr1、Lr2和Lr3以来，小麦抗叶锈病基因的研究取得了显著进展。截至目前，已正式命名的小麦抗叶锈病基因超过80个，这些基因分布在小麦的不同染色体上，对不同叶锈菌生理小种表现出不同的抗性。

根据抗性机制，小麦抗叶锈病基因可分为小种专化抗性基因和非小种专化抗性基因。小种专化抗性基因对特定的叶锈菌小种具有高度抗性，但容易因病原菌小种的变异而丧失抗性；非小种专化抗性基因则表现为成株期抗性，具有较广泛的抗谱和持久的抗病性。

在已克隆的小麦抗叶锈病基因中，Lr1、Lr9、Lr21等基因编码的蛋白具有典型的核苷酸结合位点（NBS）和富含亮氨酸重复序列（LRR）结构域，参与植物的抗病信号传导过程。例如，Lr21基因编码的蛋白能够识别叶锈菌的无毒蛋白，激活下游的抗病反应，从而使小麦表现出抗病性。此外，一些基因如Lr34、Lr46等还具有多效性，不仅赋予小麦对叶锈病的抗性，还对其他病害如条锈病、白粉病等具有一定的抗性。

近年来，随着分子生物学技术的不断发展，越来越多的小麦抗叶锈病基因被定位和克隆，为深入研究小麦抗叶锈病的分子机制提供了基础。同时，利用分子标记辅助选择技术，将多个抗叶锈病基因聚合到同一品种中，有望培育出具有持久抗病性的小麦新品种。

1.3mRNA差异表达研究方法及应用

mRNA差异表达研究旨在揭示不同样品之间基因表达水平的差异，从而鉴定出与特定生物学过程相关的基因。目前，常用的mRNA差异表达研究方法包括cDNA-AFLP、RNA-Seq等。

cDNA-AFLP（cDNA-amplifiedfragmentlengthpolymorphism）技术结合了AFLP和RT-PCR的优点，是一种高效的mRNA差异表达分析方法。该方法首先将样本mRNA反转录并合成双链cDNA，然后用两种限制性内切酶（通常一种识别4个碱基，另一种识别6个碱基）同时进行酶切，将人工接头与酶切后的粘性末端连接，用与接头互补的引物进行预扩增，再在引物的3′末端加上2-3个选择性碱基进行选择性扩增，最后通过聚丙烯酰胺凝胶电泳检测扩增产物，分析不同样本间mRNA表达的差异。cDNA-AFLP技术具有多态性丰富、重复性好、灵敏性高、对RNA需要量较少、抗干扰力强、假阳性低等优点，无需了解序列信息，可准确地反映基因间表达量的差异，对生物体转录组进行全面、系统的分析，成本相对较低。该技术已广泛应用于植物胚胎发育、形态发生、果实发育、信号传导、抗逆性、抗病性以及植物与真菌互作相关基因的比较鉴定与克隆等领域。例如，在小麦抗叶锈病研究中，李星等利用cDNA-AFLP技术研究了与小麦抗叶锈病LY41基因相关的差异表达基因，获得了多个与抗病相关的转录衍生片段（TDFs）。

RNA-Seq（RNAsequencing）即转录组测序技术，是基于二代测序平台发展起来的一种高通量测序技术。该技术能够对细胞或组织中的全部转录本进行测序和定量分析，不仅可以检测