DB53-T 861-2018 香蕉枯萎病PCR 检测技术规程.docxVIP

DB53T12018香蕉枯萎病PCR检测技术规程

1范围

本标准规定了香蕉枯萎病（Fusariumwiltofbanana）PCR检测的原理、试剂与材料、仪器设备、样品采集与处理、DNA提取、PCR反应体系、PCR反应程序、结果判定及废弃物处理等技术要求。

本标准适用于香蕉植株、土壤及其他可能携带香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）的样品中病原菌的PCR检测。

2规范性引用文件

下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。

GB/T6682分析实验室用水规格和试验方法

GB19489实验室生物安全通用要求

SN/T2122进出境植物检疫实验室生物安全操作规范

3术语和定义

下列术语和定义适用于本标准。

3.1香蕉枯萎病Fusariumwiltofbanana

由尖孢镰刀菌古巴专化型（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）侵染引起的香蕉维管束系统性病害，又称巴拿马病。

3.2PCR聚合酶链式反应PolymeraseChainReaction

一种体外酶促合成特异性DNA片段的方法，由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤组成的热循环过程。

3.3引物Primer

与待扩增DNA片段两端互补的寡核苷酸序列，用于引导DNA合成。

3.4阳性对照Positivecontrol

含有已知目标DNA序列的样品，用于验证PCR反应体系的可靠性。

3.5阴性对照Negativecontrol

不含目标DNA序列的样品，用于检测PCR反应过程中是否存在污染。

4原理

本标准基于香蕉枯萎病菌（Fusariumoxysporumf.sp.cubense）特异性DNA序列设计引物，通过PCR技术对样品中可能存在的病原菌DNA进行扩增检测。PCR反应过程中，引物与目标DNA序列特异性结合，在TaqDNA聚合酶的作用下，经过变性、退火和延伸的循环过程，特异性扩增目标片段。通过电泳检测扩增产物，根据预期片段大小判断样品中是否含有香蕉枯萎病菌。

5试剂与材料

5.1主要试剂

5.1.1无DNA酶的蒸馏水或超纯水（GB/T6682，一级水）

5.1.210×PCR缓冲液（含Mg2?）

5.1.3dNTP混合液（各2.5mmol/L）

5.1.4TaqDNA聚合酶（5U/μL）

5.1.5上游引物（10μmol/L）：5GGCCTCCAAAGGGTAATCA3

5.1.6下游引物（10μmol/L）：5CGGTTTGAACGTCACTTGAC3

5.1.7DNA分子量标准（100bpDNALadder）

5.1.8琼脂糖

5.1.950×TAE电泳缓冲液

5.1.10溴化乙锭（EB）或其他核酸染料

5.1.11液氮

5.1.12CTAB提取缓冲液：2%CTAB，100mmol/LTrisHCl（pH8.0），20mmol/LEDTA（pH8.0），1.4mol/LNaCl

5.1.13氯仿:异戊醇（24:1）

5.1.14异丙醇

5.1.1570%乙醇

5.2主要材料

5.2.1PCR反应管（0.2mL或0.5mL）

5.2.2微量移液器吸头（10μL、200μL、1000μL）

5.2.3离心管（1.5mL、2.0mL）

5.2.4研钵和研杵

5.2.5电泳槽和电泳仪

5.2.6紫外凝胶成像系统

5.2.7恒温水浴锅

5.2.8高速冷冻离心机

5.2.9PCR扩增仪

5.2.10微量移液器（0.510μL、10100μL、1001000μL）

5.2.11电子天平（精度0.001g）

5.2.12pH计

5.2.13灭菌蒸馏水

5.2.14医用纱布

5.2.15无菌手术刀

5.2.16一次性手套

5.2.17口罩

5.2.18实验服

6仪器设备

6.1PCR扩增仪：温度控制精度±0.5℃，升降温速率≥2.0℃/秒。

6.2高速冷冻离心机：最高转速≥15000r/min，温度控制范围20℃~40℃。

6.3电泳仪：输出电压0~300V可调，输出电流0~500mA可调。

6.4紫外凝胶成像系统：波长302nm，分辨率≥300万像素。

6.5微量移液器：量程0.5~10μL、10~100μL、100~1000μL，精度±1.5%。

6.6电子天平：量程0~200g，精度0.001g。

6.7恒温水浴锅：温度控制范围室温~100℃，精度±0.5℃