第六章基因的重组与转移.pptVIP

脱菌培养把共培养后的外植体转移到含有抗生素的培养基上继续培养生长，达到抑制和杀死农杆菌。头孢霉素脱菌培养时间，一般需5～6次继代培养，甚至一直到试管苗形成。另外，还需将外植体转移至筛选培养基上继续培养，筛选出被转化的细胞，经再分化培养成再生植株。第57页，共82页，星期日，2025年，2月5日几种常用的农杆菌Ti质粒转化方法叶盘转化法植株接种共转化法植物愈伤组织共培养转化法原生质体共培养转化法植物悬浮细胞培养转化法第58页，共82页，星期日，2025年，2月5日叶盘法转化植物细胞Leafdishtransformation由Horsch等于1985年发展起来的一种转化方法第59页，共82页，星期日，2025年，2月5日四、DNA体外连接应注意的事项插入片断与载体的酶切位点互补相同的粘性末端才能有效地连接。尽量避免平端连接。决不能进行非粘性末端连接。第25页，共82页，星期日，2025年，2月5日EcoRIEcoRIEcoRI（1）用相同的酶切（2）用同尾酶切BamHI、BclI、BglII、Sau3AI、XhoII都产生GATC4个碱基的粘性末端。第26页，共82页，星期日，2025年，2月5日2.DNA插入的方向正确用双酶切由于产生的粘性末端不同，只能以固定方向连接。EcoRIBamHIEcoRIBamHIEcoRIBamHI第27页，共82页，星期日，2025年，2月5日3.插入基因的开放阅读框（ORF）正确（1）DNA定向插入（2）起始密码尤其当载体上有ATG起始密码的时候，更要注意。ATGGAATTC载体ATGCGGAATTCT插入片断EcoRIEcoRIATGGAATTCT重组但移码突变！第28页，共82页，星期日，2025年，2月5日4.防止载体自身环化连接（1）提高插入片断的用量连接反应体系中，插入片断比载体多10倍以上。（2）用碱性磷酸酶处理载体载体切口的5’磷酸被除去，不能自我连接。但可以与插入片断以单链连接。5’3’载体插入片断第29页，共82页，星期日，2025年，2月5日1.载体自身环化连接（能存活）2.载体之间互相连接（能存活）3.插入片段互相连接（不能存活）4.一个载体与几个插入片段重组（能存活）五、载体和外源DNA插入片段的连接结果5.几个载体与一个插入片段重组（能存活）第30页，共82页，星期日，2025年，2月5日第31页，共82页，星期日，2025年，2月5日1.目的增加受体菌细胞膜的通透性。第二节重组体导入细菌细胞一、感受态大肠杆菌的制备第32页，共82页，星期日，2025年，2月5日使用丧失了限制体系的大肠杆菌。如K12系列的大肠杆菌。2.菌种第33页，共82页，星期日，2025年，2月5日第34页，共82页，星期日，2025年，2月5日用CaCl2处理大肠杆菌，能增加膜的通透性。3.制备原理第35页，共82页，星期日，2025年，2月5日4.制备过程培养大肠杆菌OD600至0.3-0.4Onice5-10min4℃离心收集菌用冰冷的60mMCaCl2重悬4℃离心收集菌4℃离心收集菌分装、-70℃冻存用冰冷的60mMCaCl2重悬Onice30min用冰冷的60mMCaCl2重悬第36页，共82页，星期日，2025年，2月5日二、重组DNA导入大肠杆菌（1）转化（transformation)大肠杆菌捕获质粒DNA的过程。（2）转染（transfection)大肠杆菌捕获噬菌体DNA的过程。1.外源DNA导入细菌的几种方法（3）转导（transduction)借助噬菌体把外源DNA导入细菌的过程。第37页，共82页，星期日，2025年，2月5日3.转化方法2.转化率简单，但转化效率不高（106-108/?gDNA）。（1）热休克法（heatshock）转化效率高（高于109/?gDNA）。（2）电转化法转化率是指DNA分子转化受体菌获得转化子的效率，有两种表示方式：一是以转化子数与用于转化处理的DNA分子数或质量的比率表示；二是以转化子数与用于转化处理的受体细胞数的比率表示。用每单位质量的DNA分子获得的转化子数来表示，难以反映分子大小与转化率之间的关系。第38页，共82页，星期日，2025年，2月5日10ng载体DNA100?L感受态菌Onice混合，静置10分钟42oC1分钟加入1mLLB培养基37℃摇1小时10-100?L转化液涂含抗菌素的平板吸附DNA摄入DN