第四章 凝胶排阻.pptVIP

组别分离一般选用交联度较大的凝胶层析介质，例如，蛋白质脱盐可选用葡聚糖凝胶SephadexG-25或聚丙烯酰胺凝胶Bio-GelP-6、Bio-GelP-10。组分分离要根据被分离组分所预测的最大相对分子质量的上限值和最小相对分子质量的下限值的分离范围来选择合适的凝胶。如分离相对分子质量在5000～60000之间的多种组分，可选用葡聚糖凝胶SephadexG-75或UltrolGelAcA54。*第61页，共93页，星期日，2025年，2月5日2.凝胶粒度的选择选择凝胶粒度的大小，主要是基于分离样品是层析的规模或相邻两组分相对分子质量的差异进行选择。粒度较大的凝胶介质流速快，适于具有一定规模的分离或者组别分离，但由于其颗粒大层析时涡旋扩散影响较大，被分离组分在柱内容易扩散，分辨率较低。粒度较小的凝胶介质适于分析分离，层析时涡旋扩散影响较小，组分在柱内扩散小，分辨率相对较高，但流速较慢。实验室常用的凝胶介质的粒度范围是中粗级。*第62页，共93页，星期日，2025年，2月5日凝胶介质粒度的均匀性也是很重要的，凝胶介质的最大颗粒和最小颗粒的差值越小越好，说明介质的均匀度好。均匀度好的介质流速相对于均匀度差的介质快，效率高。*第63页，共93页，星期日，2025年，2月5日二、层析柱的选择层析柱的选择，主要考虑被分离组分相对分子质量的差异，选用相应的柱长与柱内径之比的层析柱。对于组别分离的层析柱，由于被分离的组分相对分子质量差别较大可采用短粗的层析柱，柱长度：柱内径=10：1或20：1，如脱盐柱。对组分分级分离的层析柱，用细长的层析柱；柱长度：柱内径=50：1或100：1，如蛋白质组分分离。*第64页，共93页，星期日，2025年，2月5日三、流动相的选择排阻层析所使用的缓冲溶液比较简单，一般只使用一种缓冲液。但是在选择缓冲溶液时主要考虑3方面的因素：1.考虑被分离物质的稳定性，包括缓冲液的pH值、离子强度及保护剂等。2.考虑凝胶介质的稳定性能，不与介质发生化学反应，不变形，不降解。3.考虑分离物质的后处理，被分离组分经排阻层析分离后还需采用其他层析方法进行分离(如用离子交换或亲和层析分离等)，最好选用与后续层析方法相同的缓冲液。如果后处理是冰冻干燥，可选用易挥发性的溶液。如NH4HC03、HAC或NH40H等。*第65页，共93页，星期日，2025年，2月5日四、样液的制备排阻层析的样液在上样前，要进行适当的处理，去部分杂质。样液的浓度不宜太稀，组分不宜太多，质量至少要相差±2000以上。*第66页，共93页，星期日，2025年，2月5日3.具有较好的耐受性凝胶颗粒对温度和有机溶剂具有较好的耐受性，尤其是对物理聚合的凝胶，在高温下(100℃左右)不发生熔融，在有机溶剂中凝胶的体积不发生收缩变形。4.刚性好凝胶颗粒具有一定机械强度，在允许的操作压范围内，柱床体积保持稳定，在层析的过程中流速不发生改变。*第29页，共93页，星期日，2025年，2月5日二、凝胶层析介质的分类目前，常用于排阻层析的凝胶类介质主要有4大类，即葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖-聚丙烯酰胺混合凝胶等层析介质。1.葡聚糖凝胶层析介质葡聚糖凝胶层析介质是由多聚葡聚糖通过与环氧氯丙烷交联而合成的，是一类具有网状结构的珠状凝胶颗粒。葡聚糖凝胶交联的程度(简称交联度)与凝胶颗粒网状结构孔径的大小有直接关系，交联度越大，网状结构的孔径越小，分离的分子量就小；反之，交联度越小，网状结构的孔径越大，分离的分子量就大。葡聚糖凝胶交联结构如图4。*第30页，共93页，星期日，2025年，2月5日*第31页，共93页，星期日，2025年，2月5日交联的葡聚糖不溶于有机溶剂和水的聚合物，但由于其结构中含有大量的羟基，又具有很强的亲水性，能迅速在水和电解质溶液中溶胀，在层析过程中非常容易与水溶性溶质接触。合成的葡聚糖凝胶在酸性条件下糖苷键容易被水解，在碱性环境中比较稳定。一般在0.25mol／LNaOH溶液中，60℃的条件下放置两个月以上仍不改变其原有的基本性质。所以常用稀碱溶液处理葡聚糖凝胶层析介质，以除去残留在凝胶介质上的变性蛋白和其他杂质。*第32页，共93页，星期日，2025年，2月5日在氧化剂的作用下葡聚糖凝胶上的羟基容易氧化成羧基，增加了带电荷基团，容易与溶液中的离子化合物发生交换反应，使其非特异性吸附的能力增强，从而影响分离效果和回收率。葡聚糖凝胶对温度具有较好的耐受性，通常在溶胀状态的葡聚糖凝胶可以耐受1