猪链球菌特性及分离鉴定方法.docx

链球菌属（Streptococcus）

链球菌属是革兰阳性球菌，种类多，在自然界分布甚广，有些能引起人及多种动物发病，导致化脓、肺炎、乳腺炎、败血症等病症。与兽医学有关的链球菌有无乳链球菌（S.agalactiae）、停乳链球菌（S.dysgalactiae）、酿脓链球菌（S.pyogenes）、肺炎链球菌（S.pneμmoniae）、马链球菌兽疫亚种（S.equissp.zooepidimicus）、猪链球菌（S.suis）等。其中，猪链球菌2型可引起猪脑膜炎、败血症、脓肿等；本菌也可感染人，引起脑膜炎、感染性休克，严重时可导致人死亡。

猪链球菌（S.suis）

1.形态染色

革兰阳性，圆形或椭圆形，单个或双个，少数呈短链状排列。陈旧培养物可能呈革兰阴性，在液体培养基中以链状为主，能形成荚膜，无芽孢（图3-1-1）。

2.培养特性

多数兼性厌氧，最适pH为7.4～7.6，最适培养温度为36℃。营养要求丰富，接种在哥伦比亚（TSA、脑心浸液琼脂）血平板上36℃培养24h，形成细小、圆形微凸、表面光滑而湿润的灰白色菌落，菌落直径1～2μm。α或β溶血，有的为α溶血，但延时培养后则变为β溶血[图3-1-2]。猪链球菌2型在绵羊血平板上呈α溶血，而在马血平板上则为β溶血。在BHI、TSB、马丁肉汤（添加动物血清）等液体培养基培养，肉汤混浊。

3.生化反应

触酶阴性，七叶苷、精氨酸双水解酶、淀粉水解试验阳性，不分解甘露醇，V-P、马尿酸钠试验阴性，10℃、45℃、6.5%NaCl、pH9.6肉汤中均不生长。

4.分离鉴定

（1）猪链球菌分离鉴定流程：扁桃体、鼻腔拭子可接种到选择性THB增菌液试管中，36℃培养24～48h后再划线接种到血平板上。猪链球菌在血平板上形成α或β溶血、圆形的小菌落，革兰阳性，短链；触酶试验阴性，不分解甘露醇，纯培养细菌可以进一步用商品化细菌鉴定试剂盒进行鉴定。

（2）猪链球菌与其他细菌鉴别：主要有以下几种。

①猪链球菌与肠球菌鉴别：猪链球菌在45℃、6.5%NaCl、pH9.6肉汤中均不生长，而肠球菌均生长。

②猪链球菌与葡萄球菌鉴别：猪链球菌触酶试验阴性，6.5%NaCl培养基不能生长；葡萄球菌触酶试验阳性，6.5%NaCl培养基能生长。

③猪链球菌与马链球菌兽疫亚种鉴别：按兰氏分群，猪链球菌为R群，马链球菌兽疫亚种为C群。按菌落形态分，猪链球菌为光滑、圆形的小菌落，短链；马链球菌兽疫亚种为黏液的露滴状菌落，长链。按溶血性分，猪链球菌为α溶血或β溶血，β溶血不明显；马链球菌兽疫亚种在血平板上为明显的β溶血。

（3）猪链球菌血清型鉴定：猪链球菌根据荚膜抗原的不同分为33个血清型（1～31、33及1/2）及相当数量无法定型的菌株（non-typeablestrains，NT），其中1、2、7、9型为猪的致病菌。血清凝集或协同凝集是当前鉴定猪链球菌各血清型的经典方法。将待检菌落接种THB肉汤，于36℃培养18h±2h，取1.5ml培养物经10000r/min离心3min，弃上清，加100μl生理盐水将沉淀悬浮，取25μl菌体悬液分别与猪链球菌标准血清和生理盐水进行玻片凝集试验，同时设阳性对照，生理盐水对照不凝集、阳性菌株凝集，试验成立。

（4）PCR检测

①对病料分离的纯培养物可进行猪链球菌、猪链球菌1、2、7、9型、猪链球菌毒力因子和猪链球菌MLSTPCR（分子分型）检测，可用煮沸法提取细菌DNA。

②猪链球菌通用扩增体系：premix12.5μl，ddH2O8.5μl，引物各0.5μl，模板2μl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，扩增30个循环；72℃延伸10min（图3-1-4）。

③猪链球菌1、2、7、9型扩增体系：premix12.5μl，ddH2O8.5μl，引物各1μl，模板2μl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃30s，各自退火温度30s，72℃1min，扩增30个循环；72℃延伸10min。

④猪链球菌7个毒力因子扩增体系：可分为以下两个扩增体系。

a.扩增体系1（fbps、gdh、orf2和mrp）:premix12.5μl，引物fbps0.6μl、gdh0.7μl、orf21.2l、mrp0.2μl各1μl，模板3μl，用ddH2O调整终体积至25μl。扩增条件为：94℃预热5min；94℃30s，56℃30s，72℃1min，扩增40个循环；72℃延伸10min。

b.扩增体系2（sly、gapdh、epf）:premix12.5μl，引物sly、gapdh各0.7μl，epf0.2μl，DNA模板3μl，用ddH2O调整终体积至25μl。扩增条件：94℃预热5min，94℃30s，52℃30s，72℃1m