基因工程载体.pptVIP

?DNA进入细菌体内后，可形成双链环状DNA复制型（RFDNA）。第158页，共244页，星期日，2025年，2月5日?噬菌体和其DNA第159页，共244页，星期日，2025年，2月5日DNA上有至少61个基因，有一半是必须的，与自身的活动有关，成簇排列。其他约1/3是非必须基因（位于尾部合成至阻遏蛋白基因之间的区段）。2.?噬菌体的基因组特点第160页，共244页，星期日，2025年，2月5日?genome(48502bp)第161页，共244页，星期日，2025年，2月5日?噬菌体感染细菌的早期：双链进行?型复制。3.?DNA的复制模型（1）?型复制第162页，共244页，星期日，2025年，2月5日（2）滚环复制感染的晚期：启动滚环复制机制。形成多联体?DAN分子。第163页，共244页，星期日，2025年，2月5日滚环复制第164页，共244页，星期日，2025年，2月5日这种多联体分子必须在cos位点被切断成单体分子才能被包装起来。第165页，共244页，星期日，2025年，2月5日（1）构建原理：4.?噬菌体载体的构建（2）构建过程①在这个非必须区内制造限制酶切点②引进某些突变表型，作为选择标记③突变某些基因，使它成为安全载体④删除?DNA必须区段上常用的限制酶切点?噬菌体DNA上本身有5个EcoRI和7个HindIII切点！删除?噬菌体的非必需区，留出插入空间。第166页，共244页，星期日，2025年，2月5日（3）人工构建的?噬菌体载体有两种类型：①插入型载体（insertionvectors)：如?gt10、?gt11、?BV2、?NM540、?NM1590、?NM6071）免疫功能失活型：插入位点位于载体合成活性阻遏物区域（cI基因）内。EcoRIcI?gt10第167页，共244页，星期日，2025年，2月5日插入导致载体不能合成阻遏物，??载体DNA不能进入溶源期，受体菌全部裂解，形成清晰的噬菌斑。没有外源DNA插入的?载体感染受体菌形成混浊噬菌斑。选择标记:如?NM1149载体的两个克隆位点（EcoRI和HindIII）都是位于cI基因内部。第168页，共244页，星期日，2025年，2月5日2）?-半乳糖苷酶失活型载体：在?基因组中引入了LacZ’序列。（其上含有一个EcoRI克隆位点）。感染LacZ突变的大肠杆菌，经IPTG的诱导，利用Xgal的显色反应作选择标记。LacZ’EcoRICharon16A选择标记:第169页，共244页，星期日，2025年，2月5日②替换型载体（substitutionvectors)两个多克隆位点区以反向重复形式分别位于?DNA的非必须区两端。用酶切后，可以将中间的区段切下来，与用同样酶切成的外源DNA片段置换。可置换区MCSMCS如：?EMBL4、Charon40等。13第170页，共244页，星期日，2025年，2月5日1）?EMBL4?EMBL4的可置换片段内部还有SalI酶切位点。以便于进一步消化中间片段，防止自我连接。左臂可置换区右臂EcoRIBamHISalISalIBamHIEcoRISalISalI?EMBL4第171页，共244页，星期日，2025年，2月5日（3）M13载体系列加上常用的酶切位点。①M13载体系列的命名M13mpnn代表系列数字②对M13mp1的改进B.Gronenborn和J.Messing1978年把LacZ’5’端的第16个核苷酸G突变成A，产生了一个EcoRI切点。M13mp2：第126页，共244页，星期日，2025年，2月5日5’ATGACCATGATTACGGATTCA-Me用N-甲基-N-亚硝基脲把G甲基化5’ATGACCATGATTACGGATTCA-转染E.coli。mG与T配对，复制两次后5’ATGACCATGATTACGAATTCA-EcoRI切点用EcoRI切M13mp1M13mp2选择能切开的线性分子再环化M13mp1第127页，共244页，星期日，2025年，2月5日③对M13mp2的进一步改进在M13mp2的LacZ’的5‘端加上一段人工合成的多克隆位点（MCS）。M13mp7、M13mp8、M13mp9、M13mp10、M13mp11、M13mp18、M13mp19对应有相同MCS的pU