母乳中低聚糖定量检测方法的建立及其应用的研究.pdfVIP

致谢

在告别之时，人们心中时光匆匆如流水的想法会被放大。十分幸运进入了浙大，让我

有机会感受这里的一年四季以及点滴生活，南华园的静谧，启真湖的风光还有农生环的学

习进步，都成为我最值得珍藏的回忆。回首这短暂的三年，有许多人帮助我顺利走完研究

生的全程，在这里请允许我表达我真挚的感谢！

首先要感谢我的导师李铎教授。衷心感谢李老师对我学习以及论文写作上的指导，帮

助我顺利完成毕业课题。李老师对待科研一丝不苟、细致入微的治学态度，是我今后不论

学习工作还是为人处世都需要借鉴的！

其次，感谢我的合作导师任一平教授，他对于对自己热衷的领域所展现的赤子之心让

我很受触动。感谢任老师创造的优越的实验室环境以及传授的仪器操作本领，以及在课题

和生活上的巨大帮助。

感谢邂逅DuoLiGroup这个大家庭的成员，顾娇娇师姐，高金龙师兄，李克磊师兄，

郭晓飞师兄，万漪师姐，李娇妹师姐，唐俊师兄，李子豪师兄，卢梦青师姐。感谢带我共

同学习进步的周仁客同学，很幸运收获了这样一个内心赤诚善良、积极向上的良师益友。

感谢滨江实验室团队的支持，感谢赖世云师兄、杨国良师兄、胡玲玲师姐、周慧师姐

贾伟师兄，王兴龙师兄、程军师兄、陈雨湉师兄、蒋易蓉师姐、胡蓓师姐、周荧师姐、毛

蕾同学在课题以及实验仪器使用学习上的悉心指导与帮助。

最后，感谢我的家人。感谢父母对我的无条件支持，感谢你们的付出与关爱，你们是

我的坚实的后盾，有你们，真好。特别感谢我的女朋友陆昭君同学，两年的异国与一年的

异地让你我共同成长，感谢你对我的包容与鼓励，有你真好。

童文烽

2020年03月于浙江嵊州

摘要

背景：母乳是公认的新生儿最佳的营养来源，其成分中丰富的母乳低聚糖（Humanmilk

oligosaccharides,HMOs）是仅次于乳糖和脂肪的第三大组分。HMOs具有诸多对婴幼儿生

长发育有益的生理功能，明确HMOs在母乳中的含量及其影响因素对于开发更接近母乳

的婴幼儿配方食品有重要意义。由于本身无发色基团，HMOs在检测器上灵敏度较低，利

用还原胺化反应进行衍生可大大提高灵敏度。质谱在靶向分析方面的准确性与重复性均十

分优秀，本研究基于还原胺化反应，利用超高效液相色谱串联质谱平台建立6种HMO的

同步定量检测方法，同时将方法应用于实际母乳样品的定量检测，分析哺乳阶段与地理差

异对目标HMOs含量的影响。

方法：基于还原胺化反应，对2’-岩藻糖基乳糖（2’-FL），3’-岩藻糖基乳糖（3’-FL），3’-

唾液酸乳糖（3’-SL），6’-唾液酸乳糖（6’-SL），乳-N-岩藻五糖-I（LNFP-I）和乳-N-岩藻

五糖-V（LNFP-V）这6种HMOs分别进行2-氨基苯甲酸（2-aminobenzoicacid,2-AA）、

2-氨基苯甲酰胺（2-aminobenzamide,2-AB）和2-氨基吖啶酮（2-aminoacridone,AMAC）

衍生化处理。随后结合高分辨率质谱与三重四极杆质谱的扫描结果，建立质谱多反应监测

（MRM）方法并对锥孔电压和碰撞能量进行优化，然后确定最优衍生剂，经液相条件优化

后利用超高效液相-串联质谱（UPLC-MS）平台，针对6种HMOs建立同步快速的MRM

质谱定量方法，并从线性回归、检出限、回收率和精密度四个方面对方法进行方法学验证

工作。应用上述建立的方法对母乳样品中这6种HMOs进行定量分析，数据分析采用独立

样本T检验和单因素方差分析（ANOVA）。

结果：1.母乳中6种HMOs质谱同步定量方法的建立

对HMOs分别进行2-AA、2-AB与AMAC衍生，比较后选取2-AA作为最优衍生剂，

并进行了液相条件的优化，选定25mM甲酸铵水溶液为水相，纯乙腈为有机相，利用超

高效液相色谱-串联质谱平台建立了6种母乳低聚糖的定量检测方法并通过了相应的方法

学验证。所建立的方法前处理步骤简单，分析时间短，能够在14min内完成6种目标HMO