小鼠胚胎干细胞培养.docVIP

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以下培养针对于小鼠的R1胚胎干细胞系，其它胚胎干细胞的培养可以参考。不过人的胚胎干细胞培养不可以采用下面的protocol，需要用专用的protocol和培养基。

一般培养－－维持ES细胞处于未分化状态

ES细胞培养用含有LIF（白血病抑制因子）和Feed细胞的培养基（高糖）来阻止细胞的分化。为细胞提供包被有0.1％明胶的平板作为粘附细胞的基质。建议每2－3天从达到80％－90％融合的平板按1：8的比率传代细胞一次，细胞传代以后，在将细胞接种在0.1％明胶包被的培养皿之前，通过预先将细胞接种在没有经过包被的组织培养板2个小时，使分化细胞粘附，从而将分化和未分化细胞分开。将细胞全程置于37℃，5％CO2，100％湿度条件下培养。如果在Feed细胞，那么就需要采用MMC进行处理，抑制Feed细胞增殖，但仍然能保持其分泌LIF因子的活性。下文中暂不提及Feed细胞。Feed细胞可以来源于STO细胞或原代胚胎成纤维细胞。

培养基

ES:

配制一20×不含DMEM，HS，LIF的溶液（该溶液也能用于EB培养基－－见下文）。分装在50ml离心管中，（稀释为2×，每管42ml），贮存在-20℃。通过将21ml该溶液，HS和LIF加入450mlDMEM中制备培养基，0.22μm滤膜过滤。贮存于4℃，时间不要超过2周。

贮存液??????????

DMEM（高糖）??????????

马血清（HS）??????????

L-谷氨酰胺（200mM）??????????

MEMNEAA（10mM）??????????

HEPES（1M）??????????

β-巯基乙醇（55Mm）??????????

PEST??????????

LIF?????????

复苏细胞

细胞被冻存在10％二甲基亚砜（DMSO）中防止结晶的形成，结晶的形成会损害细胞。然而，二甲基亚砜对细胞有毒性，快速的进行细胞复苏是很重要的。

步骤：

1．从液氮中取出一管细胞；

2．将冻存管置于37℃水浴中2分钟（或放到管内溶液恰好完全溶解）；

3．将细胞转移到一15mlFalcon管中；

4．加入5mlES培养基（用培养基冲洗冻存管）；

5．离心3分钟；

6．弃上清，用2mlES培养基重悬细胞，至少吹打10次；

7．接种在明胶包被（见下文）的6孔或6cm组织培养皿；

8．孵育。

冻存细胞

冻存液

90％HS和10％DMSO

步骤：

1．1×PBS洗细胞并留少许PBS在培养皿内；

2．用细胞刮刀收集细胞；

3．将细胞转入15ml离心管管内并离心3分钟；

4．弃去上清并将细胞重悬于冷的冻存液中（10cm的培养皿用2ml，15cm的培养皿用6－7ml。）

5．分装于冻存管内，每管1ml；

6．置－80℃过夜，第二天移入液氮。

Geltin（明胶）包被

准备500ml0.1％geltin溶液

1．将0.5g明胶溶解在500ml无钙镁的PBS中（50－65℃水浴15～30分钟）。

2．最好在溶液没有冷却的情况下通过0.22μm滤膜过滤，贮存在4℃。

包被培养板或培养皿

1．加入足量的明胶溶液覆盖培养平面（15cm培养皿加2ml，10cm培养皿加0.5～1ml，溶液的量并不重要，只要能完全覆盖培养表面就行了。）；

2．置室温30分钟；

3．去除明胶溶液，将培养板贮存在包装袋中室温放置，最好将板子平放或倒扣，以免明胶污染盖子和流出培养板。

细胞传代

建议每2天传代细胞一次，过度生长的细胞会降低细胞的自然分化率，我们建立了一种纯化方法来去除分化细胞，在将细胞接种在明胶包被的培养板上之前，通过将分化细胞黏附在没有包被的组织培养板上去除分化细胞。纯化步骤包含在下面的方法中。

1．去除培养液；

2．无钙镁PBS（Gibco）洗涤；

3．加入胰酶EDTA（Gibco）。37℃孵育5分钟。

4．加入ES培养基使胰酶失活；

5．将细胞转入15ml离心管中离心3min；

6．去除上清，将细胞重悬于2mlES培养基，至少吹打10－20次。

如果加入培养基的量较少会比较容易将细胞团弄散分开。ES细胞有聚集成团的倾向，传代过程中仔细将细胞弄散分开很重要。这样可能会减少细胞的自然分化。

7．将细胞接种在没有包被的组织培养皿中（使用和一开始同样规格的培养皿）放入温箱2小时（分化细胞在该时间内将黏附，而ES细胞仍将保持悬浮）；

8．将含有细胞的培养基转入geltin包被的组织培养皿。吹打以确保细胞被分散开（前面已经提到－－ES细胞有聚集成团的倾向）

9．建议按1：4－1：10的比率传代（ATCC）

保持细胞的传代比率很重要，以我们的经验，1：

6．用EB培养基培养的第4天将细胞转入没有包被的组织培养皿中（这即是细胞的移植步骤）